酵母雙雜交技術(shù)篩選與CD44相互作用的單鏈抗體.pdf

1、CD44是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間相互作用的多功能I型跨膜蛋白，被鑒定為癌癥干細(xì)胞的表面標(biāo)記，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲中發(fā)揮重要的作用，與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。本研究采用新方法篩選與CD44存在相互作用的單鏈抗體，用于CD44的靶向治療，即采用酵母雙雜交技術(shù)從人單鏈抗體文庫(kù)中鉤選目的抗體。
　　首先，將CD44胞外段基因插入pGBKT7質(zhì)粒的EcoRI與BamHI位點(diǎn)之間，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CD44，然后將誘餌質(zhì)

2、粒轉(zhuǎn)化酵母AH109，進(jìn)行毒性和自激活檢測(cè)。再將人單鏈抗體cNDA文庫(kù)轉(zhuǎn)化已攜帶誘餌質(zhì)粒的酵母AH109，使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。將得到的36個(gè)候選陽(yáng)性克隆進(jìn)行兩輪劃線篩選(分別在SD/–Leu/–Trp/X-α-Gal和SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-Gal板上劃線)及回復(fù)性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，以排除假陽(yáng)性克隆。經(jīng)過(guò)回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)后，得到20個(gè)陽(yáng)性的scFv抗體克隆，分別進(jìn)行測(cè)序分析其DNA順序和抗體結(jié)構(gòu)。通過(guò)哺乳動(dòng)物雙雜