大腸桿菌cDNA文庫(kù)的建立及與RNaseⅢ有相互作用蛋白的篩選.pdf

1、分類號(hào)學(xué)校代碼!Q5壘2密級(jí)學(xué)號(hào)2Q!lQ21壘13Q魚大腸桿菌cDNA文庫(kù)的建立及與RNaseIII有相互作用蛋白的篩選ConstructionofacDNALibraryofEcoliandscreeningofproteinsinteractwithRNaseIII研究生姓名肖些指導(dǎo)教師姓名、職稱囪丞鹽熬援湖南師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)辦公室二零一四年四月cDNA片段，與pTRGXR載體連接后，電擊轉(zhuǎn)入XLl一BLUEMRF’菌電轉(zhuǎn)感

2、受態(tài)中。得到原始文庫(kù)，經(jīng)計(jì)算文庫(kù)的容量達(dá)到3106個(gè)克隆。用PCR方法測(cè)得文庫(kù)的重組率為100％，插入片段的平均長(zhǎng)度基本位于300bp以上，測(cè)定放大文庫(kù)的滴度為：3151010pfu／mL。說明構(gòu)建的大腸桿菌eDNA文庫(kù)質(zhì)量比較高，適合用于篩選目的基因克隆。文庫(kù)的篩選，將pBT-RNaselII質(zhì)粒和pTRGeDNA文庫(kù)質(zhì)粒電擊共轉(zhuǎn)入XLlBLUEMRF’篩選菌中。在篩選平板上兩次篩選后得到379個(gè)克隆，挑取這379個(gè)克隆做菌落PCR，

3、對(duì)PCR產(chǎn)物按大小分組后再經(jīng)MSPI酶切，剔除酶切片段一致的克隆，最終得到169個(gè)克隆。其中有35個(gè)克隆重復(fù)次數(shù)達(dá)到三次以上，全部測(cè)序后在NCBI中做BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大部分的克隆為16SrRNA和23SrRNA，也發(fā)現(xiàn)一些與糖代謝有關(guān)的酶，如吡哆醛激酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、異檸檬酸脫氫酶等，或許細(xì)菌RNaseIII酶也參與細(xì)菌的糖代謝。本次主要研究16SrRNA克隆，在體外經(jīng)GST-PULLDOWN實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNaseIII和16SrRNA片段