一種基于TCC的大腸桿菌染色體相互作用高通量測定方法.pdf

1、細菌作為地球上最古老的物種之一，具有比真核生物更簡單的細胞結構和獨特的遺傳物質組織調(diào)節(jié)方式。作為遺傳學上經(jīng)典的模式生物，大腸桿菌的染色體以1000倍以上的比例壓縮凝聚在細胞中，與細胞中的蛋白質，RNA等共同構成擬核結構。近年來的研究表明細菌染色體并不是像人們過去認為的那樣雜亂的壓縮在擬核區(qū)域內(nèi)，而是有著一定的層次，經(jīng)過有序地包裝，組織來形成高級結構。
　　細菌基因組中被同一個轉錄因子調(diào)節(jié)的操縱子可組成調(diào)節(jié)子(regulon)結構。

2、有研究表明組成同一調(diào)節(jié)子的操縱子之間可能在線性距離上相距甚遠，但是可以通過染色體的高級結構在空間上相互作用。這說明細菌基因表達過程可被遠程調(diào)控元件所調(diào)控，且存在三維空間網(wǎng)絡。所以染色體的高級結構不但能夠使得細菌的基因組高度凝聚以適應較小的擬核空間，同時也廣泛的影響著細菌的基因調(diào)控過程。
　　細菌染色體內(nèi)部存在著廣泛的相互作用，在擬核范圍內(nèi)形成復雜的高級結構。為了探明擬核內(nèi)染色體的相互作用情況，并得到染色體內(nèi)高通量互作數(shù)據(jù)，我們參考

3、了最新的高通量染色體構象俘獲TCC技術，對部分步驟進行了修改，建立了一種高通量測定細菌的全基因組核酸交互的方法。將對數(shù)期生長的大腸桿菌菌體用濃度為1％的甲醛進行細胞交聯(lián)，選取超聲波物理打斷的方式進行無偏好性的核酸片段化，蛋白質核酸的復合物補齊末端后，生物素化標記樣品中的蛋白，利用近距離連接反應的原理進行分子內(nèi)末端的連接。將帶有生物素標記純化連接片段克隆到載體PCR擴增后進行測序，驗證實驗方案的可行性。在所有的克隆測序結果中，有10％～2

4、0％的克隆片段是由來自不同基因座位的序列拼接而成的。初步驗證了實驗方案的可行性。
　　借鑒TCC(TetheredConformationCapture)中將擬核蛋白生物素化處理的方法，使交聯(lián)復合物分子固定在支持物上進行連接，避免了游離片段之間的隨機接觸，提高了增加了連接片段的可信度。另一方面利用生物素化的蛋白質作為親和純化標簽篩選交聯(lián)復合物，大大提高了高通量篩選的效率。繼而通過第二代測序技術得到高通量的大腸桿菌染色體的相互作用數(shù)

5、據(jù)。利用生物信息學工具對高通量數(shù)據(jù)進行分析處理，結果表明大腸桿菌K-12菌株對數(shù)生長期細胞內(nèi)染色質內(nèi)部存在廣泛的交互，且這些交互多集中在復制起始位點附近，且經(jīng)過COG分類表明染色質交互高峰區(qū)域基因的功能與對數(shù)生長期最旺盛的細胞過程如細胞分裂，轉錄翻譯，物質代謝等相匹配。
　　通過對染色質構象捕獲技術及TCC技術的借鑒，經(jīng)過實驗條件的優(yōu)化和有限片段克隆測序的驗證以及對高通量測序數(shù)據(jù)的分析處理，我們初步建立了可適用于第二代高通量測序平