一種高通量定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是目前生物技術(shù)制藥產(chǎn)業(yè)廣泛采用的技術(shù)平臺(tái),細(xì)胞凋亡的發(fā)生是培養(yǎng)中限制產(chǎn)量和增加成本的主要環(huán)節(jié),預(yù)防并控制凋亡也因此成為研究的熱點(diǎn).進(jìn)行凋亡控制的重要前提是對(duì)其進(jìn)行早期檢測(cè).該研究以雜交瘤細(xì)胞G7為研究對(duì)象,用DNA交聯(lián)染料YO-PRO-1(簡(jiǎn)稱YP)聯(lián)合PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞因膜通誘性的差異而著染為不同的顏色,從而將三者區(qū)分開來(lái).分別借助熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)YP/PI染色的細(xì)胞凋亡情況

2、,將其檢測(cè)結(jié)果與公認(rèn)較為準(zhǔn)確的AV/PI流式細(xì)胞儀方法進(jìn)行比較,表明前兩者與后者有顯著的相關(guān)性,并且沒有顯著差異,因此可以用YP/PI染色的方法代替AV/PI流式法檢測(cè)細(xì)胞凋亡.在此基礎(chǔ)上,證明實(shí)了經(jīng)染色的細(xì)胞YP/PI熒光強(qiáng)度與凋亡/壞死細(xì)胞數(shù)具有顯著的相關(guān)性,因而可以通過(guò)檢測(cè)YP/PI熒光強(qiáng)度定量凋亡/壞死細(xì)胞數(shù).該研究?jī)?yōu)化了熒光分光光度計(jì)檢測(cè)所需的各種條件,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,使用3μMYP,4μg/ml PI,于37℃孵育8m

3、in,用Ex/Em為485/538和530/590兩組濾光片分別檢測(cè)YP和PI的熒光強(qiáng)度.結(jié)合細(xì)胞密度的計(jì)數(shù)結(jié)果(細(xì)胞計(jì)數(shù)板、MTT比色法等),建立了用YP、PI熒光強(qiáng)度值計(jì)算細(xì)胞凋亡和壞死百分?jǐn)?shù)的方法.實(shí)驗(yàn)證實(shí),該方法可檢測(cè)出樣品中少至100個(gè)的凋亡細(xì)胞,具有很高的靈敏度;檢測(cè)在96孔板中即可進(jìn)行,操作簡(jiǎn)便,快速省時(shí),因而適于高通量應(yīng)用.將該方法應(yīng)用于尋找培養(yǎng)體系中的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要因素和篩選有效的抗凋亡藥物方面,結(jié)果證明培養(yǎng)體系中

4、葡萄糖、胱氨酸、谷氨酰胺等營(yíng)養(yǎng)成分的缺乏,pH降低等因素能夠誘導(dǎo)G7細(xì)胞發(fā)生凋亡.通過(guò)篩選幾種化學(xué)藥物,證實(shí)了在無(wú)gln和無(wú)葡萄糖兩種情況下,caspases抑制劑Z-VAD-FMK均能夠有效的抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,是一種有應(yīng)用前景的抗凋亡藥物.用低劑量的Staurosporine處理半貼壁培養(yǎng)、呈球形的G7細(xì)胞,在不明顯影響細(xì)胞活力的條件下,可引起細(xì)胞發(fā)生伸展變形,成為類似成纖維細(xì)胞的形狀.檢測(cè)了該現(xiàn)象所伴隨的細(xì)胞生長(zhǎng)代謝及細(xì)胞周期分布