五種大鼠和小鼠重要病毒熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、大鼠和小鼠是生物醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中用途最廣和使用量最大的實(shí)驗(yàn)動物，實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量決定了科研結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的SPF級實(shí)驗(yàn)大鼠和小鼠必須或必要檢測的病毒項(xiàng)目是15種，除此之外，依然有不少病毒危害著實(shí)驗(yàn)鼠的健康。本研究選取5種暫未列入我國SPF級實(shí)驗(yàn)動物檢測標(biāo)準(zhǔn)的大鼠和小鼠病毒，分別為大鼠細(xì)小病毒（Rat parvovirus，RPV）、大鼠微小病毒(Rat minute virus，RMV)、鼠腦心肌炎病毒（Enc

2、ephalomyocarditis virus，EMV）、小鼠輪狀病毒(Murine Rotavirus，MRV)和大鼠疑似泰勒氏病毒(Theiler's-like virus of Rats，TLV)，以這些病原為研究對象，分別建立快速、準(zhǔn)確的診斷方法，為實(shí)驗(yàn)動物的健康監(jiān)護(hù)提供技術(shù)支撐。
　　1.RMV和RPV雙重TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立和應(yīng)用
　　以實(shí)驗(yàn)大鼠中常見的兩種細(xì)小病毒RMV和RPV為研究對象，根

3、據(jù)GenBank中已公布的RMV的NTU1株全基因組序列（GenBank登錄號:JX627317.1），在3389～3589 bp處設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針。以及RPV的NTU1毒株全基因組序列(GenBank登錄號:JX827169)，在863-967 bp處設(shè)計(jì)引物和Taqman探針。以構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板建立熒光定量PCR檢測方法，并對該鑒別檢測方法的靈敏度、穩(wěn)定性和特異性進(jìn)行評價;用建立的熒光定量方法對50份臨床樣品進(jìn)行檢測

4、，并用ELISA的商品試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證該方法的可靠性。結(jié)果顯示，建立的RMV和RPV的雙重?zé)晒舛縋CR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，R2值可達(dá)0.99，最低檢測限可以達(dá)到30拷貝/μL，使用建立的熒光定量PCR方法和血清學(xué)ELISA檢測試劑盒，同時對50只大鼠的肝臟樣本和血清樣品進(jìn)行對應(yīng)的檢測，檢測準(zhǔn)確性為100％。因此，建立的RMV和RPV雙重TaqMan實(shí)時熒光定量PCR方法具有特異、靈敏的特點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)大鼠臨床的監(jiān)測。

5、>　　2.EMV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法建立
　　根據(jù)EMV的PEC9毒株全基因組序列（GenBank登錄號:DQ288856.1），設(shè)計(jì)一對特異性引物和TaqMan探針，建立EMV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法，通過條件優(yōu)化，對其特異性，敏感性，穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，建立的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，R2值可達(dá)0.99;敏感性最低檢測限達(dá)到1拷貝/μL，高于普通PCR方法1000倍

6、;其特異性強(qiáng)，常見的小鼠病毒株均無特異性擴(kuò)增;重復(fù)性好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2％。利用該方法對上海市120份小鼠腦組織樣品進(jìn)行檢測，未檢測到陽性感染鼠，本研究為EMV病毒感染的分子檢測、制定國家標(biāo)準(zhǔn)提供良好的方法。
　　3.MRV的TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測方法建立
　　根據(jù)MRV的EB-C8/G16P毒株VP1基因（Genbank登錄號:KJ477127.1），設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，構(gòu)建擴(kuò)增曲線，制

7、作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立MRV熒光定量RT-PCR方法，并檢測其特異性、敏感性和穩(wěn)定性，從而初步建立檢測方法并應(yīng)用于動物房小鼠的檢測。結(jié)果顯示:建立的MRV熒光定量RT-PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，R2值可達(dá)0.99;最低檢測到10拷貝/μL，是常規(guī)PCR的100倍;與常見的小鼠病毒株均無特異性擴(kuò)增;批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2％，表明該方法重復(fù)性好。所建立的MRV熒光定量RT-PCR方法具有特異、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。對上海市120份小鼠腸道

8、樣品的檢測的結(jié)果，為MRV的流行病學(xué)調(diào)查、及國家/地方標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了可靠的借鑒。
　　4.TLV的熒光定量RT-PCR檢測方法的建立
　　為了建立一種能在臨床上快速、準(zhǔn)確地檢測TLV的方法，我們運(yùn)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)的技術(shù)，特異性地針對TLV病毒核酸進(jìn)行檢測。根據(jù)GenBank中TLV代表毒株NGS910的全基因組序列（GenBank登錄號:AB090161.1），通過基因合成序列作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的模板

9、，同時根據(jù)3622～3729 bp的特異性序列，設(shè)計(jì)引物和TaqMan性探針，優(yōu)化反應(yīng)體系及條件，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，從而建立起了TLV的TaqMan探針qRT-PCR方法，并對其靈敏度、穩(wěn)定性和特異性進(jìn)行評價。結(jié)果顯示，建立的TLV的qRT-PCR檢測方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，R2值可達(dá)到0.99，靈敏度可達(dá)30個拷貝/μL，靈敏度是普通PCR的100倍;且該qRT-PCR方法特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1％。因