NGAL mRNA熒光定量PCR檢測方法的建立及初步評價.pdf

1、目的： 中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是lipocalin家族的新成員，于1993年在人中性粒細胞中被發(fā)現(xiàn)。近年來眾多研究表明NGAL基因參與若干腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能是人類的一種重要的癌基因；Goets等的研究還顯示在細菌入侵機體后，NGAL可以作為鐵載體介導阻礙細菌對鐵的捕獲，從而抑制細菌的生長，是一種重要的細菌抑制劑；NGAL

2、還參與腎小管上皮發(fā)生的及功能調(diào)控，對急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）等腎臟功能的診斷價值比傳統(tǒng)的AKI實驗室指標血肌酐更為快速和準確，是AKI最強有力的預測因子。因此對NGAL基因的檢測亦顯得尤為重要。本課題研究的目的就是建立NGAL mRNA的熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）檢測方法，并將此方法應(yīng)用于臨床結(jié)腸癌患者腫瘤組織、癌旁組織及正常組織NGAL

3、mRNA的檢測，初步驗證其應(yīng)用價值。 方法： 1.根據(jù)NGAL基因序列，設(shè)計并合成PCR引物，將PCR擴增的特異片段克隆入T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定、定量后作為標準品。 2.在上述NGAL擴增片段內(nèi)部設(shè)計FQ-PCR引物，通過正交設(shè)計方式對PCR引物濃度、退火溫度、SYBRgreenⅠ染料（Mg2+）濃度等PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化，從而建立NGALmRNA的檢測方法。 3.將高濃度標準品質(zhì)粒進行系列稀釋，

4、用上述優(yōu)化的FQ-PCR方法進行檢測，以NGAL拷貝數(shù)為橫坐標，循環(huán)閾值為縱坐標繪制標準曲線，用于被測物的絕對定量。 4.對該檢測方法進行敏感性、特異性及重復性等方法學評價。 5.將建立的FQ-PCR用于臨床結(jié)腸癌患者腫瘤組織、癌旁組織及正常組織NGALmRNA的檢測，其結(jié)果與普通PCR相比較。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGM-T-NGAL。 2.確立了FQ-PCR最佳反應(yīng)條件：SYBR10

5、×Buffer（withMg2+）2μl、dNTPs0.2mmol/L、上游、下游引物各0.32μmol/ml、SYBRTaqTM1.25μl、ddH2O15.15μl，退火溫度60.0℃。 3.制作的標準曲線相關(guān)系數(shù)為98.9％，無非特異性擴增。建立了以NGAL mRNA SYB RgreenⅠ染料技術(shù)為基礎(chǔ)的實時熒光定量PCR方法，其線性檢測范圍為102～109copies/μl；靈敏度為10copies/μl.高拷貝樣品的

6、天間CV為3.57％、批內(nèi)CV為2.95％，低拷貝樣品的天間CV為3，24％、批內(nèi)CV為1.85％；特異性好； 4.對臨床標木的檢測結(jié)果與預期設(shè)想完全相符。腫瘤組織、癌旁組織正常組織的NGAL mRNA水平呈明顯的下降梯度。與普通PCR相比，該檢測方法靈敏度要高約100倍。 結(jié)論： 我們成功構(gòu)建了FQ-PCR檢測體系和NGA LmRNA的定量標準品，其快速、靈敏、特異的特點適合臨床實驗室的應(yīng)用。為臨床NGAL m