新型熒光定量PCR檢測HBV方法的建立及初步臨床應用.pdf

1、目的：目前用于檢測HBV的熒光定量PCR產(chǎn)品所需檢測時間較長，成本較高，本實驗擬利用二聚體蝎型熒光探針技術(shù)建立一種能廣泛應用于臨床的快捷、價格低廉、敏感、特異和穩(wěn)定性較好的新型HBV實時熒光定量PCR檢測方法。 方法：根據(jù)HBV基因組保守區(qū)域設(shè)計二聚體蝎型熒光探針和引物，采用基因克隆技術(shù)，將目的片段插入到載體pMDl8-T中，獲得含有該基因片段的克隆質(zhì)粒，以此作為標準品。優(yōu)化熒光定量PCR條件，建立以二聚體蝎型熒光探針技術(shù)為平臺

2、的實時熒光定量PCR方法，并對所建立的方法進行方法學評價。最后用該方法對臨床收集疑為乙型肝炎病毒感染的患者血清標本進行檢測并和Taqman-FQ-PCR方法進行比較。 結(jié)果：1)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMDl8-T-HBV-Precore／core；2)建立了以二聚體蝎型熒光探針技術(shù)為基礎(chǔ)的實時熒光定量PCR方法，其線性檢測范圍為102～109copies／μl；靈敏度為10copies／gl；高拷貝樣品的天間CV為3．86％、批內(nèi)

3、CV為3．00％，低拷貝樣品的天間CV為2．57％、批內(nèi)CV為1．71％；特異性好；3)通過初步臨床應用發(fā)現(xiàn)，所建立的FQ-PCR方法與已商品化的Taqman-FQ-PCR方法相比，不僅具有較好的敏感性和特異性，而且檢測時間大大縮短，成本更低，值得向臨床推廣應用。 結(jié)論：在國內(nèi)外首次應用二聚體蝎型熒光探針技術(shù)建立了HBV新型熒光定量PCR檢測方法，為HBV新型檢測試劑盒的研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)奠定了堅實的基礎(chǔ)，同時也對應用二聚體蝎型熒