檢測HBVcccDNA的巢式-實時熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，嚴重危害人們的生命健康。 我國是HBV 感染的高發(fā)區(qū)，由于缺乏有效的治療方法，每年約30 萬人死于HBV 慢性感染所引發(fā)的重型肝炎、肝硬化和肝癌等相關(guān)疾病。防治HBV 感染是我國極為重要的公共衛(wèi)生問題之一。 臨床和實驗發(fā)現(xiàn)，一些乙肝患者血液中HBV-DNA 雖已轉(zhuǎn)陰，但病情并未緩解，病毒復(fù)制仍未停止，停用抗病毒藥物后，病情仍可復(fù)發(fā)。原因就在于HBV 共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA

2、）的存在。cccDNA 是HBV 基因組（雙鏈松弛環(huán)狀DNA，rcDNA）進入肝細胞核后轉(zhuǎn)變而成。它是HBV 前基因組RNA 復(fù)制的原始模板，是病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵因素，也是HBV 復(fù)制最特異的指標。只有清除體內(nèi)的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)。 抗HBV 藥物能有效清除外周血中的HBV，但對細胞核內(nèi)cccDNA 影響甚微。 檢測HBVcccDNA 有助于更進一步了解HBV 的復(fù)制狀態(tài)和抗病毒治療效果。

3、 國內(nèi)外學者進行了大量探索，建立多種檢測HBVcccDNA 的方法，但因特異性和敏感性等問題，未用于臨床。 基于上述原因，本課題研究將巢式PCR 與實時熒光定量PCR 相結(jié)合，建立一種特異、靈敏的巢式-實時熒光定量PCR 方法，用于慢性乙肝患者PBMC 和血清標本中HBVcccDNA 的檢測，為研究HBV 復(fù)制、評價抗病毒藥物療效、指導臨床制定合理的個體化治療方案以及評價移植肝臟是否被再感染等提供重要手段。 本項課題

4、主要研究內(nèi)容包括以下四個方面： 1、HBVcccDNA 定量標準品的制備 用pBR322 ADR質(zhì)粒（命名P1.2Ⅱ）作為定量檢測HBVcccDNA的標準品。 該質(zhì)粒包含adr型HBV全基因組，其HBV的直接重復(fù)序列（DR）附近不存在缺口，為完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，與HBVcccDNA結(jié)構(gòu)、性質(zhì)類似。首先進行質(zhì)粒擴增，然后用紫外分光光度計進行定量，取3 次A值的平均值，再由公式： 質(zhì)?？截悢?shù)＝（M/W）×6.02

5、×1023計算出拷貝數(shù)，根據(jù)需要做適當稀釋，作為陽性參照定量標準品。 2、HBVcccDNA 實時熒光定量PCR 檢測方法的建立 根據(jù)HBV基因組DNA與cccDNA結(jié)構(gòu)上的差異及理化性質(zhì)的不同，設(shè)計一對跨雙鏈缺口的特異性引物及一條位于負鏈缺口下游的特異性TaqMan探針，用熒光定量PCR儀，擴增跨雙鏈缺口的特異性HBV-DNA片段（約365bp）。 模板DNA制備先用質(zhì)粒提取試劑去除部分rcDNA，再用Plas

6、mid-SafeTMATP-Dependent Dnase（PSAD）進行酶切純化，進一步降解rcDNA。 3、HBVcccDNA 巢式-實時熒光定量PCR 方法的建立 熒光定量PCR 的敏感性受擴增片段大小的影響，最適片段大小為50-150bp，片段過大，敏感性下降。因此，將巢式PCR 與熒光定量PCR 相結(jié)合，建立巢式-實時熒光定量PCR。設(shè)計一對跨雙鏈缺口的外引物和一對跨負鏈缺口的內(nèi)引物及一條位于負鏈缺口下游的Ta

7、qMan 探針。用上述方法處理、純化模板。用外引物對模板進行普通PCR 擴增，所得到的跨雙鏈缺口425bp 產(chǎn)物再用內(nèi)引物和熒光探針進行實時定量PCR 擴增。根據(jù)陽性定量標準品，測出待檢標本中cccDNA 的起始拷貝數(shù)。 4、慢性乙肝患者PBMC 及血清HBVcccDNA 的定量檢測 采用建立的巢式-實時熒光定量PCR 方法，檢測了34 例CHB 患者的PBMC 和血清標本、14 例非活動性HBsAg 攜帶者和12 例體

8、檢者的血清標本中HBVcccDNA。首先用質(zhì)粒提取試劑盒提取患者PBMC 中的DNA，用QIAamp MinElute Virus Spin Kit 提取血清中的DNA，再用不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA 酶(Plasmid-Safe ATP-dependent Dnase, PSAD)酶切純化模板，最后進行巢式-實時定量PCR 擴增，并對患者ALT、血清HBV-DNA、HBVcccDNA及PBMC 中HBV-DNA、cccDNA 進行相

9、關(guān)性分析，評價其臨床意義。 結(jié)果： 1、實時熒光定量PCR方法檢測HBVcccDNA的下限為1×105copies/mL。敏感性較低，難以滿足臨床檢測需要。 2、巢式-實時熒光定量PCR方法檢測HBVcccDNA的下限為1×102copies/mL。 敏感性較單純實時熒光定量PCR提高了1000 倍。擴增陽性產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定，無堿基缺失、突變，且與Genbank中HBV基因序列同源性達98％～100％，表明

10、具有良好的特異性。 3、34 例CHB 患者血清和PBMC 中HBV-DNA 均為陽性。PBMC 中檢出28例（82.35％）cccDNA，定量對數(shù)值范圍在2.38～5.31；血清標本中25 例（73.53％）檢出cccDNA，定量值范圍在2.34～5.62。（文中均以定量對數(shù)值表示定量拷貝值，描述為定量值） 4、14 例非活動性HBsAg 攜帶者血清標本中有6 例（42.86％）檢出cccDNA，定量值范圍在2.80～

11、3.48。12 例體檢者中2 例抗HBs 陽性者血清中檢出cccDNA，定量值分別為3.14 和3.68。 5、對34 例患者ALT、血清中HBV-DNA、cccDNA 及PBMC 中HBV-DNA、cccDNA 及HBV 免疫標志物定量檢測值進行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清cccDNA 與血清HBV-DNA 及PBMC 中HBV-DNA 呈顯著正相關(guān)；HBsAg 與血清cccDNA 呈顯著相關(guān)，其它各因素間未見明顯相關(guān)性。

12、結(jié)論: 1、本文建立的巢式-實時定量PCR 檢測方法具有較高的特異性和敏感性，能定量檢測血清、PBMC 標本中的HBVcccDNA。 2、CHB 患者PBMC 和血清標本中HBVcccDNA 含量均較低。PBMC 中檢出cccDNA，提示PBMC 可能成為CHB 患者肝外cccDNA 的“儲存池”,可作為臨床評估抗HBV 療效、確定抗病毒治療的終點，預(yù)測病情復(fù)發(fā)的指標。 3、CHB 患者外周血血清中檢測出HBVc