犬瘟熱、犬細(xì)小病毒二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病分別是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus, CDV）和犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus, CPV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，是當(dāng)前嚴(yán)重危害犬、貓健康的主要疫病，由于二者引起的臨床癥狀相似且往往混合感染，因此單憑臨床癥狀和病理剖檢難以做出鑒別診斷，必須借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段確診。目前缺乏對(duì)兩種疫病進(jìn)行快速鑒別診斷的實(shí)驗(yàn)室方法，因此迫切需要建立一種特異、敏感、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法以實(shí)

2、現(xiàn)臨床上對(duì)這兩種病的快速鑒別診斷。
　　本研究經(jīng)大量比對(duì)GenBank中CDV的H基因和CPV的VP2基因序列，選取高度保守且具有型特異性的基因序列為模板，分別設(shè)計(jì)2對(duì)CDV/CPV特異性引物對(duì)和2條TaqMan MGB探針，分別以含有CDVH基因、CPVVP2基因的pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV重組質(zhì)粒為模板，將CDV/CPV上下游引物對(duì)分別稀釋至終濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.

3、7、0.8和1.0μmol/L，CDV/CPV探針?lè)謩e稀釋至終濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0μmol/L，采用矩陣法篩選兩對(duì)熒光引物和兩條Taq Man MGB探針的最佳濃度組合；將Ex Taq酶濃度稀釋至終濃度為0.03、0.05、0.07 U/μL，退火溫度分別選擇56℃、58℃、60℃、62℃、64℃，篩選最佳酶濃度和反應(yīng)條件，建立CDV、CPV二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR（flu

4、orescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR）檢測(cè)方法。將pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV重組質(zhì)粒等體積等濃度混合并10倍系列稀釋成濃度為1.0×107~1.0×100拷貝/μL，進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，建立檢測(cè)CDV和CPV的標(biāo)準(zhǔn)曲線；分別以10倍梯度稀釋的1×108~1×100拷貝/μL的pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV為模板，進(jìn)行CDV/CPV常規(guī)PCR并與二重FQ-PCR檢測(cè)

5、方法靈敏度對(duì)比；對(duì)67份已測(cè)序鑒定為CDV/CPV陽(yáng)性的樣品抽提核酸進(jìn)行二重FQ-PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的敏感性；分別以CDV、CPV細(xì)胞培養(yǎng)物以及兩種細(xì)胞培養(yǎng)物的等量混合物為模板，以Vero細(xì)胞和FK81細(xì)胞為陰性對(duì)照，同時(shí)對(duì)CPIV、RV、CAV-1、CAV-2、PPV5種對(duì)照病原以及92份無(wú)CDV/CPV感染健康犬糞便樣品進(jìn)行二重FQ-PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證方法的特異性；采用不同濃度組合的兩種重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行干擾性試驗(yàn)，確定模板濃度相

6、差較大時(shí)CDV和CPV之間的檢測(cè)是否存在相互干擾現(xiàn)象；分別將10倍系列稀釋的pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV重組等量質(zhì)?；旌衔铮糠N質(zhì)粒終濃度1.0×103~1.0×100拷貝/μL）進(jìn)行3個(gè)重復(fù)二重FQ-PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證該方法的檢測(cè)穩(wěn)定性和可重復(fù)性；對(duì)48份臨床疑似犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病病料進(jìn)行臨床初步應(yīng)用試驗(yàn)，并與CDV/CPV常規(guī)PCR方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
　　結(jié)果顯示，優(yōu)化后的二重FQ-PCR方法的CDV、CP

7、V上下游引物最佳濃度均為0.8μmol/L，CDV、CPV探針最佳濃度分別為0.6μmol/L和0.7μmol/L；最佳Ex Taq聚合酶濃度為0.05 U/μL；最優(yōu)的退火溫度為60℃；該方法檢測(cè)pGEM-T/CDV、pGEM-T/CPV的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)數(shù)（R2）分別為0.997和0.993，最低檢出限均為1×101拷貝/μL，是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的100倍；67份已知CDV/CPV陽(yáng)性樣品的二重FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明該方

8、法敏感性為100％；特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，CDV、CPV細(xì)胞培養(yǎng)物以及兩種細(xì)胞培養(yǎng)物的等量混合物模板均檢測(cè)為陽(yáng)性，陰性對(duì)照、5種對(duì)照病原以及92份健康犬糞便樣品均為陰性，說(shuō)明該方法特異性良好；干擾性試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種病毒同時(shí)存在或單個(gè)存在，或濃度相差較大時(shí)，均不影響對(duì)其中任一病毒的準(zhǔn)確定量；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度為1.0×103~1.0×101拷貝/μL的3個(gè)濃度的pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV重組質(zhì)粒等量混合物3次試驗(yàn)結(jié)果

9、均為陽(yáng)性，濃度為1.0×100拷貝/μL的重組質(zhì)粒等量混合物3次試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明建立的二重FQ-PCR方法具有很好的重復(fù)性；48份臨床疑似犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病病料FQ-PCR方法和常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)Q-PCR檢出14份單一CDV陽(yáng)性，20份單一CPV陽(yáng)性，4份雙陽(yáng)性。常規(guī)RT-PCR檢測(cè)出7份單一CDV陽(yáng)性，19份單一CPV陽(yáng)性，2份雙陽(yáng)性。表明建立的二重FQ-PCR方法比常規(guī)RT-PCR或PCR方法的靈敏性高。