鵝細(xì)小病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用及其VP3基因序列分析.pdf

1、鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)是小鵝瘟的病原，可引起4～20日齡雛鵝的急性或亞急性敗血性感染，也能感染雛番鴨。其傳播速度快，發(fā)病率、死亡率都很高，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。所以本試驗(yàn)旨在建立一種快速、特異、準(zhǔn)確的診斷GPV的熒光定量PCRfFluorescence Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)方法，并用該方法對(duì)病毒在雛鵝體內(nèi)分布規(guī)律進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，為指導(dǎo)臨床診斷樣品的采集保證診斷的可靠性

2、與準(zhǔn)確性和對(duì)該病的診斷監(jiān)測(cè)提供了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。此外，還分別將來(lái)自國(guó)內(nèi)的4個(gè)GPV毒株，通過(guò)PCR技術(shù)從病毒基因組DNA中擴(kuò)增出病毒VP3完整基因片段進(jìn)行克隆及序列比較，為鵝細(xì)小病毒感染的預(yù)防和疫苗的選擇提供了一定的理論依據(jù)。 本研究共分四部分： 一、GPV山東株的分離鑒定采取山東某鵝場(chǎng)發(fā)病典型的商品代鵝和本實(shí)驗(yàn)室保存2002年病料的心臟、肝臟、腸道等組織臟器，制成乳劑；接種于12曰齡鵝胚尿囊腔，結(jié)果接種后72

3、～192 h內(nèi)，鵝胚死亡，死亡率95％，且鵝胚呈出血狀；接種3日齡雛鵝，結(jié)果表明試驗(yàn)組雛鵝能夠表現(xiàn)出小鵝瘟臨床癥狀，而對(duì)照組正常；瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示與鵝細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)株陽(yáng)性血清有明顯沉淀線；參照GenBank GPV標(biāo)準(zhǔn)株B株結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得目的條帶，克隆測(cè)序后，與GPV B株序列同源性達(dá)98％。綜合以上生物學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可確定分離到2株GPV，并命名為SI)2002株和SD200

4、5株。 二、LUX<'TM>引物熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCRFQ-PCR)檢測(cè)GPV方法的建立根據(jù)國(guó)際GeneBank 1995年發(fā)布的鵝細(xì)小病毒(GPV)B株的全基因組序列，針對(duì)GPV的保守基因片段VP1設(shè)計(jì)一對(duì)LUX<'TM>引物，建立了一種用于檢測(cè)GPV的特異的FQ-PCR方法，該法能夠特異地?cái)U(kuò)增出預(yù)期大小約為62bp特征性片段。特異性實(shí)驗(yàn)證明，該法對(duì)鴨瘟病毒(DPV)、雛鵝新

5、型病毒性腸炎病毒(NGVEV)和正常鵝胚尿囊液及鵝組織DNA均呈陰性反應(yīng)；靈敏性實(shí)驗(yàn)證明，該方法能夠檢出GPV基因質(zhì)粒達(dá)10<'3>個(gè)拷貝數(shù)，檢測(cè)到的GPV病毒核酸最低量可以達(dá)到2.5pg。三、熒光定量PCR檢測(cè)雛鵝人工感染GPV后病毒在體內(nèi)分布規(guī)律用建立的FQ-PCR檢測(cè)鵝細(xì)小病毒的方法，檢測(cè)3日齡GPv抗體陰性雛鵝經(jīng)口服加滴鼻的方法人工感染GPV后，各器官不同時(shí)間段的病毒含量。結(jié)果表明：在攻毒8h后能從舌、各個(gè)腸段、糞、消化系統(tǒng)、血

6、液、心臟和肝臟中檢測(cè)到病毒DNA；病毒DNA的含量在．48h后達(dá)到最高峰并一直維持到168h，這段時(shí)間在每個(gè)待檢臟器中均能檢測(cè)到大量病毒DNA：隨后各待檢臟器中病毒DNA含量持續(xù)降低，但在720h后仍能從糞、肝臟和脾中檢測(cè)到少量的病毒DNA。本研究為指導(dǎo)臨床診斷樣品的采集保證診斷的可靠性和準(zhǔn)確性以及對(duì)該病的診斷監(jiān)測(cè)提供了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。 四、GPV不同毒株主要結(jié)構(gòu)蛋白VP3基因的序列比較分析根據(jù)發(fā)表的GPV B株基因序

7、列合成了擴(kuò)增GPV VP3基因的一對(duì)特異性引物。利用這對(duì)引物，分別將來(lái)自國(guó)內(nèi)的4個(gè)GPV毒株，通過(guò)PCR技術(shù)從病毒基因組DNA中擴(kuò)增出病毒VP3完整基因片段，將其克隆、鑒定、測(cè)序。序列測(cè)定結(jié)果顯示4個(gè)GPV毒株的VP3基因全長(zhǎng)均為1605bp，編碼534個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析比較表明：4株GPV VP3基因氨基酸編碼序列非常保守，與其它參考毒株的同源性在96.4％～99.8％之間，其中，2株山東株之間的同源性為99.3％，與其它參考毒