弓形蟲熒光定量PCR檢測方法及HRM分型方法的建立.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種呈世界性分布的人獸共患寄生性原蟲病，病原是真球蟲目、肉孢子蟲科、弓形蟲屬的剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)。該蟲可寄生在幾乎所有溫血動物的有核細(xì)胞內(nèi)，嚴(yán)重危害人類的健康及畜牧業(yè)的發(fā)展。研究報道：國內(nèi)豬的弓形蟲感染率從12％~100%不等，病死率可達(dá)60%以上。弓形蟲病正嚴(yán)重危害著中國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。目前，該蟲有三個國際公認(rèn)的傳統(tǒng)基因型，即TypeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Type

2、Ⅰ型為強(qiáng)毒基因型，Ⅱ型和Ⅲ型為弱毒基因型。本論文選取TypeⅠ型標(biāo)準(zhǔn)蟲株RH株，Ⅱ型標(biāo)準(zhǔn)蟲株P(guān)RU株及Ⅲ型標(biāo)準(zhǔn)蟲株VEG株作為研究對象，以致密顆粒蛋白7（GRA7）基因?yàn)榘谢?，建立弓形蟲病的熒光定量PCR檢測方法及弓形蟲三種標(biāo)準(zhǔn)蟲株HRM基因分型方法，為弓形蟲的分子生物學(xué)檢測、種群遺傳學(xué)及流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。
　　為建立一種弓形蟲病的快速檢測方法，在弓形蟲致密顆粒蛋白7（GRA7）基因種內(nèi)保守的區(qū)域設(shè)計種特異性引物，建立弓形蟲

3、病的熒光定量PCR檢測方法，并應(yīng)用于臨床檢測。結(jié)果顯示，該檢測方法特異性強(qiáng)，除弓形蟲陽性樣品出現(xiàn)擴(kuò)增外，豬等孢球蟲、豬附紅細(xì)胞體、新孢子蟲、犬鉤蟲、貓藍(lán)氏賈第蟲等沒有擴(kuò)增；操作簡單、快速、從提取樣品基因組到出檢測結(jié)果全程需時大概100 min左右；敏感度高、最低可以檢測到含1個拷貝靶基因的陽性質(zhì)粒及含10個速殖子的臨床樣品；穩(wěn)定性好，組內(nèi)及組間Ct值的變異系數(shù)（CV）均小于2%。用所建立的檢測方法對廣東地區(qū)9個規(guī)?；l(fā)病豬場送檢的360

4、份臨床樣品進(jìn)行檢測并結(jié)合抽樣測序，結(jié)果顯示該地區(qū)這幾個規(guī)模化豬場的弓形蟲感染率較高，樣品陽性率高達(dá)63.0%，同時提醒養(yǎng)殖場畜主要正確及時使用藥物進(jìn)行控制，加強(qiáng)監(jiān)測，避免爆發(fā)式發(fā)病。該方法對豬弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查及其防治具有一定意義。
　　為建立一種弓形蟲三種蟲株的快速基因分型方法，本研究選取弓形蟲致密顆粒蛋白7（GRA7）作為靶基因，采用HRM技術(shù)對國際公認(rèn)的三個傳統(tǒng)基因型的標(biāo)準(zhǔn)蟲株（TypeⅠ型RH株、Ⅱ型PRU株和Ⅲ型VE

5、G株）進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示，本研究所設(shè)計的引物HRM-F和HRM-R，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下能明顯區(qū)分TypeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型。HRM分型方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示、三次的組內(nèi)和組間重復(fù)性均良好；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)樣品濃度低至5×10-4 ng/μL時，HRM分型方法依然可以辨別出基因型。用所建立的分型方法對9份臨床陽性樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示4份人源樣品和1份魚源樣品為TypeⅡ型，可信度90.82%以上；2份猴源樣品為TypeⅠ型，可