美洲型及歐洲型PRRSV多重TaqMan熒光定量RT-PCR鑒別檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一種高度接觸傳染性病毒,妊娠母豬以及仔豬被感染后各自表現(xiàn)為繁殖障礙以及嚴(yán)重呼吸道疾病,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前,PRRS V臨床流行毒株既有美洲型高致病性變異毒株、經(jīng)典毒株,又有歐洲型毒株,并且流行毒株基因組仍在持續(xù)變異之中,給臨床診斷造成極大的困難,亟需建立快速、特異的PRRSV鑒別檢測

2、方法。
　　1.美洲型和歐洲型PRRSV多重TaqMan熒光定量RT-PCR鑒別檢測方法的建立及應(yīng)用
　　根據(jù)GenBank中發(fā)表的PRRSV美洲型經(jīng)典株VR-2332株、變異株JXA1以及歐洲型LV株的基因組序列差異,利用P rimer Exp ress3.0軟件包設(shè)計合成了3條T aq Man探針和2對特異性引物。經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了能同時檢測PRR SV美洲型變異株、經(jīng)典株以及歐洲型毒株的多重TaqMan熒光定量

3、RT-PCR方法。該方法線性關(guān)系好,以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.999以上;敏感性高,檢測下限為2.68拷貝/μL,比普通RT-PCR敏感100倍;組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于1.5％,具有較好的重復(fù)性;特異性強(qiáng),只能特異的擴(kuò)增PR RS V,而與豬的其他常見病毒無交叉反應(yīng)。應(yīng)用所建立多重T aq Man熒光定量RT-PCR方法,對282份疑似PPRS臨床樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,共檢測到101份PRRS V陽性,其中9

4、5份為變異毒株、6份為經(jīng)典毒株、4份為變異毒株和經(jīng)典毒株混合感染,未檢測到歐洲型毒株。
　　2.PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan熒光定量R T-PCR鑒別檢測方法的建立及應(yīng)用
　　針對PRR S V美洲型經(jīng)典株、變異株以及弱毒活疫苗T JM-F92株的基因序列差異,利用Primer Express3.0軟件包設(shè)計了3條TaqMan探針和2對特異性引物,經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了能夠同時檢

5、測并區(qū)分 PR RS V美洲型變異株、T JM-F92疫苗株及經(jīng)典株的多重T aq Man熒光定量RT-PCR方法。該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的特點,與豬的其他常見病毒無交叉反應(yīng);經(jīng)典株、變異株、T JM-F92疫苗株重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出下限均為2.68拷貝/μL,比常規(guī)P CR敏感100倍;組內(nèi)及組間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于1.5%。此外,該方法對324份疑似PP RS臨床樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果PR RS V陽性114份,其中

6、美洲型變異株105份、經(jīng)典株6份、T JM-F92疫苗株3份,變異株和經(jīng)典株混合感染4份。
　　3.CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV多重TaqMan熒光定量RT-PCR鑒別檢測方法的建立及應(yīng)用
　　本研究根據(jù)豬瘟病毒(CSFV)以及PRRSV的基因序列差異,利用Primer Express3.0軟件包設(shè)計了3條特異性TaqMan探針和3對特異性引物,對反應(yīng)條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化,建立了能同時檢測并區(qū)分C SF V以及PRRS V

7、美洲型毒株、歐洲型毒株的多重T aq Man熒光定量RT-PC R方法。該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的特點,與豬的其他常見病毒無交叉反應(yīng);檢測下限為2.68拷貝/μL;組內(nèi)及組間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于1.5%。應(yīng)用該方法對253份臨床疑似樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果病原陽性106份,其中20份為CSFV陽性,86份為美洲型PRRSV陽性,11份為CSFV和美洲型PRRSV混合感染,未檢測到歐洲型PRR SV。
　　綜上所述,本研