腸道病毒71型熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、目的：
　　 腸道病毒71型(Enterovirus71)是引起手足口病(HFMD)的重要病原，大都是幼兒感染，引起發(fā)熱，典型癥狀是在手心、腳心、口腔以及臀部出現(xiàn)多個(gè)水泡潰瘍。還會(huì)引起無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥，甚至死亡。
　　 EV71經(jīng)典的診斷方法“金標(biāo)準(zhǔn)”是病毒培養(yǎng)分離。但是這種方法需要幾個(gè)星期的時(shí)間，而且會(huì)由于病毒滴度低或者抗原漂移而阻礙。分子生物學(xué)方法如P

2、CR技術(shù)，以用于特異性的檢測(cè)EV71核酸，而且被證實(shí)比病毒分離方法更靈敏。最近，熒光PCR實(shí)驗(yàn)室病毒的鑒定上已得到廣泛認(rèn)可，因?yàn)樗哽`敏性特異性，能快速檢測(cè)。通過熒光的發(fā)射在擴(kuò)增反應(yīng)過程中的實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)檢測(cè)。
　　 隨著EV71致的手足口病引起越來(lái)越多的關(guān)注，迫切需要一種快速而特異的方法檢測(cè)出EV71，并能與其它腸道病毒鑒別，比如CA16，?？刹《镜取１疚慕⒁环N熒光RT-PCR技術(shù)，快速、敏感的從臨床標(biāo)本中檢測(cè)EV71的DNA。

3、
　　 方法：
　　 根據(jù)GeneBank發(fā)表的EV71全基因組序列，設(shè)計(jì)特異的引物與探針；用RT-PCR擴(kuò)增出226bp的片段，通過純化后，轉(zhuǎn)化入PGM-T載體中(TA克隆)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。PCR鑒定DNA測(cè)序證實(shí)構(gòu)建質(zhì)粒成功。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，優(yōu)化最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，建立最優(yōu)化的實(shí)時(shí)定量PCR方法。評(píng)價(jià)其靈敏性、特異性和可靠性，并用于檢測(cè)臨床標(biāo)本，同時(shí)與傳統(tǒng)RT-PCR和病毒分離檢測(cè)方法比較評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值

4、。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)TA克隆成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒。
　　 2.以重組質(zhì)粒為模板，確定定量RT-PCR反應(yīng)體系如下：RT-PCR Buffer10μl；EX Taq-HS0.2μl；RT Enzyme Mix2.0μl；引物0.8μl；探針0.4μl；模板RNA2.0μl總體積為20μl。反應(yīng)條件：42℃5 min；95℃10sec；95℃5sec，60℃30sec；40cycles；60℃10 min。

5、
　　 3.方法學(xué)的評(píng)價(jià)結(jié)果：繪制了以模板拷貝數(shù)為分析指標(biāo)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)方程為Y=-3.370X+49.790，r值為0.994，線性范圍較寬(102～108copies/μl)。敏感性：54份經(jīng)測(cè)序鑒定后，確定為EV71的標(biāo)本，用構(gòu)建的熒光RT-PCR法方法檢測(cè)均為陽(yáng)性。本方法絕對(duì)檢測(cè)低限(即能被檢測(cè)到的模板起始拷貝最低數(shù))為103拷貝/μl，傳統(tǒng)的RT-PCR檢測(cè)方法絕對(duì)檢測(cè)低限為104拷貝/μl，提高了100倍。特異

6、性檢測(cè)結(jié)果：CA16、?？刹《?、輪狀病毒、乙腦病毒等無(wú)特異性擴(kuò)增?？煽啃裕翰煌瑫r(shí)間檢測(cè)同一份標(biāo)本的變異系數(shù)小于11％。
　　 4.對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，熒光RT-PCR法的檢測(cè)EV71的陽(yáng)性率是61.2％。病毒分離法和普通RT-PCR法檢測(cè)的陽(yáng)性率分別是是16.4％、52.4％。
　　 結(jié)論：
　　 本研究建立的腸道病毒EV71-TaqMan熒光定量PCR方法，具有特異、靈敏、快速的特點(diǎn)，適用于由EV71感染引起的