TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)SIV-SHIV病毒RNA拷貝數(shù)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、本研究在國(guó)內(nèi)首次建立了SIV及SHIV的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)便、特異、靈敏、重復(fù)性好，為我國(guó)SIV/SHIV動(dòng)物模型的研究及艾滋病疫苗評(píng)價(jià)和應(yīng)用中病毒載量的測(cè)定提供了理想檢測(cè)方法。 病毒核酸的定量主要有三種方法：支鏈DNA檢測(cè)法(bDNA)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)及核酸序列依賴性擴(kuò)增法(NASBA)。其中real-time PCR．的應(yīng)用范圍非常廣泛，包括mRN

2、A表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的測(cè)定以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)。 鑒于real-time PCR的特異性強(qiáng)，靈敏度高、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，在本研究中，為了測(cè)定SIV/SHIV/SAIDS恒河猴血漿病毒RNA載量，建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，對(duì)本室SIV/SHIV病毒RNA定量外標(biāo)準(zhǔn)品(RS)進(jìn)行定量分析，優(yōu)化反應(yīng)體系，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量曲線，并檢測(cè)TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-P

3、CR方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性。同時(shí)將該方法與本室建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行比較，對(duì)同樣的RS標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，相同濃度的RS標(biāo)準(zhǔn)品TaqMan探針方法測(cè)得的Ct值較高，但該方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.0×10<'1>copies/μL，特異性及重復(fù)性良好，對(duì)同一樣品進(jìn)行16次重復(fù)檢測(cè)，其循環(huán)閾值的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.209，達(dá)到了很高要求。 在成功建立TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PC

4、R方法的基礎(chǔ)上，對(duì)SIVmac239、SIVmac251毒株攻毒恒河猴和SHIV-KB9攻毒恒河猴血漿中RNA病毒載量進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)，探討TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法和病毒分離結(jié)果及SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，并比較其優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)果顯示在SIVmac239、SIVmac251及SHIV-KB9感染期間，該方法可檢測(cè)到的恒河猴血漿病毒載量最高達(dá)到10<'8>copies/mL，檢出下限為10<'