Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LPA基因拷貝數(shù)變異及與穩(wěn)定性心絞痛的相關(guān)性研究.pdf

1、穩(wěn)定性心絞痛是冠心病中最常見(jiàn)的一種類型?！叭祟惢蚪M測(cè)序計(jì)劃”的完成揭開(kāi)了疾病基因組研究的新模式，現(xiàn)已證明包括穩(wěn)定性心絞痛在內(nèi)的冠心病、糖尿病、多發(fā)性硬化等復(fù)雜性疾病均為眾多微效、低危險(xiǎn)度、低外顯率的易感基因和環(huán)境因素相互作用的綜合結(jié)果。鑒定疾病易感基因，將疾病發(fā)生發(fā)展中的特征與基因多態(tài)性（特異性分子表型） 組合在一起，闡明特異性分子表型之間的相互作用及與疾病的不同表型特征的對(duì)應(yīng)關(guān)系已成為“后基因組時(shí)代”的首要任務(wù)。故對(duì)于冠心病

2、（心絞痛）易感基因的分析有著深遠(yuǎn)的意義。 既往研究表明：脂蛋白(a)[lipoprotein(a),Lp(a)] 是冠心病等動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可促進(jìn)粥樣硬化斑塊的進(jìn)展和血栓的形成。人類LPA基因定位于6q26-27，存在多種結(jié)構(gòu)變異：其Kringle VI編碼區(qū)的重復(fù)序列(K4-VNTR)和位于5’調(diào)控區(qū)1373bp處起始密碼子的前5個(gè)核苷酸(TTTTA)n的重復(fù)序列(PNR)與血Lp(a)水平密切相關(guān)。全基因組

3、的比較基因組雜交技術(shù)證實(shí)了LPA基因染色體的DNA片斷存在重復(fù)和缺失（拷貝數(shù)變異）。但目前未有文獻(xiàn)對(duì)LPA基因拷貝數(shù)變異情況進(jìn)行定量分析，亦未與疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究。 本研究目的在于：1.利用Taqman熒光探針技術(shù)，構(gòu)建LPA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。2.分析中國(guó)漢族人群脂蛋白（a）(LPA)基因拷貝數(shù)變異分布情況。3.評(píng)價(jià)中國(guó)漢族人群LPA基因與穩(wěn)定性心絞痛的相關(guān)性。 本文分為兩部分： 第一部分：利用Ta

4、qman熒光探針技術(shù)，構(gòu)建LPA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。 方法：參照GeneBank收錄的目的基因LPA和內(nèi)參基因ALB基因組全序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成引物及Taqman探針，分別擴(kuò)增長(zhǎng)度為89bp和139bp的DNA片段,所擴(kuò)增片段為非特異性管家片段，將產(chǎn)物純化并連接到pMD18-T載體進(jìn)行克隆，挑取陽(yáng)性克隆菌落提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定后等拷貝數(shù)混合構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將建立的L

5、PA/ALB熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)人基因組進(jìn)行檢測(cè)，分別測(cè)試不同濃度梯度下人基因組DNA和不同拷貝數(shù)梯度下質(zhì)粒擴(kuò)增的穩(wěn)定性。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得出樣本LPA和ALB基因拷貝數(shù)的絕對(duì)值（即Quantity ct，Qct）與相對(duì)比值（即拷貝數(shù)變異值）。人基因組DNA10倍濃度梯度下稀釋以及陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍等拷貝數(shù)梯度下稀釋后，重復(fù)三次擴(kuò)增，通過(guò)計(jì)算循環(huán)閾值（CT值）的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，檢測(cè)每個(gè)樣品反應(yīng)管之間的變異系數(shù)（CV％）。選取最適宜

6、的人基因組模板擴(kuò)增濃度，隨機(jī)挑選３個(gè)樣品在一次擴(kuò)增反應(yīng)中進(jìn)行３次重復(fù)測(cè)定，再次鑒定不同樣品間變異系數(shù)。 結(jié)果：對(duì)反應(yīng)體系、循環(huán)條件、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化后獲得LPA和ALB基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的最佳反應(yīng)體系和條件。將LPA和ALB質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋后于定量PCR儀上擴(kuò)增得到擴(kuò)增曲線，據(jù)此建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：LPA標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.388,截距為29.657,相關(guān)系數(shù)為0.999,直線方程為Y=-3.388X＋29.657。

7、ALB標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.256,截距為31.713,相關(guān)系數(shù)為0.999,直線方程為Y=-3.256X＋31.713。其中，Y為循環(huán)閾值，X為質(zhì)粒模板的拷貝數(shù)。表明可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算LPA和ALB基因的絕對(duì)含量和相對(duì)比值。 對(duì)人基因組DNA10倍濃度梯度擴(kuò)增以及陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍等拷貝數(shù)梯度擴(kuò)增重復(fù)性檢驗(yàn)后，結(jié)果顯示：各組CT值變異均在合理范圍（＜5％），組間離散度小。2ng/μL為最佳樣品擴(kuò)增起始模板濃度。對(duì)多個(gè)樣品單次

8、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的重復(fù)性檢驗(yàn)示變異系數(shù)在合理范圍（＜5％），具有較高的可重復(fù)性。 結(jié)論：本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法根據(jù)目的基因LPA和內(nèi)參基因ALB的非特異性管家序列，對(duì)引物、Taqman熒光探針濃度、Tm溫度等參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)。通過(guò)制備陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品成功構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)對(duì)人基因組DNA和陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不同濃度/等拷貝數(shù)梯度下的重復(fù)性檢驗(yàn)，多樣本重復(fù)性檢驗(yàn)示變異系數(shù)小、

9、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，故對(duì)于檢測(cè)LPA基因拷貝數(shù)變異具有較高可行性。 第二部分：研究中國(guó)漢族人群脂蛋白（a）(LPA)基因拷貝數(shù)變異與穩(wěn)定性心絞痛的相關(guān)性。 方法：入選瑞金醫(yī)院穩(wěn)定性心絞痛患者203例（63.7±8.3歲，男性53.2％)，對(duì)照組207名(64.2±8.2歲，男性46.8％),獲得知情同意后采集肘靜脈血10mL,抽提DNA。利用所建立的LPA/ALB實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，比較兩組間L

10、PA基因拷貝數(shù)分布頻率，分析LPA基因拷貝數(shù)變異與穩(wěn)定性心絞痛的關(guān)系。 結(jié)果：兩組在性別和年齡上匹配，BMI指數(shù)、舒張壓(DBP)、TG、LDL-C、空腹血糖、高Lp(a)血癥(P=0.064)比例無(wú)顯著性差異，穩(wěn)定性心絞痛組吸煙者比例（P=0.008)、收縮壓（SBP）(P=0.023)、TC(P＜1×10-3)均高于對(duì)照組,HDL-C（P=0.036）低于對(duì)照組。 根據(jù)公式NLPA=（Qct LPA/ Qct ALB

11、)×2(即ALB的相對(duì)拷貝數(shù))，共檢測(cè)到NLPA=1、2、3三種LPA基因拷貝數(shù)變異情況。NLPA=1為單倍體，NLPA=2、3為多倍體，對(duì)其分布頻率進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)：LPA基因拷貝數(shù)變異在兩組的分布存在顯著性差異（χ2=13.614,P＜1×10-3）。穩(wěn)定性心絞痛組單倍體分布頻率顯著低于對(duì)照組（26.1％ vs43.5％），單倍體相對(duì)比值比OR=0.459(95％CI:0.303-0.697)。校正發(fā)病年齡、性別、BMI指數(shù)、收縮壓（

12、SBP）、舒張壓（DBP）、血糖、血脂、吸煙、高Lp(a)血癥等相關(guān)因素，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)：LPA基因單倍體相對(duì)比值比OR=0.27（95％CI:0.15-0.489，P＜1×10-3)。 根據(jù)血Lp(a)水平，將血Lp(a)≥0.3g/L定義為高Lp(a)血癥，比較LPA基因單倍體和多倍體攜帶者高Lp(a)血癥與穩(wěn)定性心絞痛的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)伪扼w攜帶者中，穩(wěn)定性心絞痛組高Lp(a)血癥比例與對(duì)照組相似（

13、36.7％ vs40.7％，P＞0.05）。多倍體攜帶者中，穩(wěn)定性心絞痛組高Lp(a)血癥比例顯著高于對(duì)照組（39.4％ vs 21.7％，P=0.028）。校正了發(fā)病年齡、性別、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、BMI指數(shù)、血脂、血糖、吸煙等相關(guān)因素后，多因素Logistic回歸分析顯示：多倍體攜帶者，高Lp(a)血癥的相對(duì)比值比OR=2.246（95％CI:1.09-4.631）。 結(jié)論：LPA基因的拷貝數(shù)變異與穩(wěn)定性心絞