Noonan綜合征相關(guān)基因突變和拷貝數(shù)變異研究.pdf

1、第一章18例Noonan綜合征患者的基因突變研究
　　 目的:探索PTPN11、SOS1、KRAS及RAF1四個(gè)主要Noonan綜合征致病基因在中國(guó)Noonan綜合征患者中的致病頻率及發(fā)現(xiàn)新突變。
　　 研究對(duì)象:根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，于2009年1月至今收集就診于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院小兒心臟外科的Noonan綜合征患兒18例。其中男性11例，女性7例。
　　 方法:抽取17例患兒及其可獲得的父母親外周靜脈血進(jìn)行G顯帶

2、染色技術(shù)，排除21三體、18三體及Turner綜合征等染色體病(5號(hào)病例已于外院行G顯帶染色技術(shù)檢測(cè))。再利用美國(guó)QIAGEN公司gDNA抽提試劑盒，按照其標(biāo)準(zhǔn)抽提流程對(duì)排除染色體病后的患兒及其可獲得的父母親外周靜脈血進(jìn)行g(shù)DNA抽提。然后對(duì)PTPN11、SOS1、KRAS及RAF1分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，利用ABI公司BigDye Terminator v1.1測(cè)序試劑盒及其3100測(cè)序儀對(duì)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。
　

3、　 結(jié)果:通過G顯帶技術(shù)我們?cè)?8例Noonan綜合征患兒中發(fā)現(xiàn)5號(hào)病例染色體結(jié)構(gòu)異常:46，XX，dup(12)(q22→q23)（該患者進(jìn)入第二章SNP array芯片技術(shù)進(jìn)一步分析）。17例患者進(jìn)入突變檢測(cè)，有3例發(fā)現(xiàn)PTPN11的錯(cuò)義突變:病例1:p.D61N，c.181G＞A;病例3:p.3N308S, c.923A＞G;病例9:p.M203I, c.606G＞A突變。以上3種突變都未收錄于the Single Nucleo

4、tide Polymor Polymorphism數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP)中。 D61N及N308S為已報(bào)道過的突變，M203I尚未有報(bào)道，為新突變。我們?cè)趯?duì)患兒的父母親及100個(gè)正常人進(jìn)行檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)上述突變。
　　 結(jié)論:1）PTPN11為Noonan綜合征的主要致病基因;2)染色體結(jié)構(gòu)異常可能是Noonan綜合征致病原因之一。
　　 第二章15例Noonan綜合征患者的拷貝數(shù)變異研究
　　 目的:探討Noonan

5、綜合征相關(guān)拷貝數(shù)變異，尋找與該疾病相關(guān)的核心基因。
　　 研究對(duì)象:第一章中G顯帶技術(shù)發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常的5號(hào)病例及經(jīng)過PTPN11、SOS1、KRAS及RAF1四個(gè)基因突變篩選后的14例Noonan綜合征患者，共15例患者。
　　 方法:利用美國(guó)illumina公司生產(chǎn)的Human660W-Quad及HumanOmni1-quad芯片，采用高通量SNParray芯片技術(shù)對(duì)15例患者的gDNA進(jìn)行CNVs檢測(cè)。并設(shè)計(jì)致病

6、CNVs中核心基因的引物，利用美國(guó)Applied Biosystems公司生產(chǎn)的ABI Step one定量PCR儀，對(duì)相應(yīng)病例的gDNA樣本實(shí)行SYBR(R) GreenⅠ嵌合熒光法Real-TimePCR，并利用Applied Biosystems的StepOne Software v2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)兩例包含核心基因的染色體區(qū)間重復(fù):病例5的大小為24Mb包含PTPN11基因的12q

7、24.1-12q24.3重復(fù);病例16的大小0.25Mb包含RAF1基因的3p25.2微重復(fù)。我們對(duì)PTPN111及RAF1關(guān)鍵基因進(jìn)行Real-time PCR，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2個(gè)致病性CNVs中的關(guān)鍵基因拷貝數(shù)約為正常對(duì)照組的1.4-1.5倍，說明其拷貝量增加，與芯片結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:1）拷貝數(shù)變異也是Noonan綜合征的致病原因之一，并已明確PTPN11及RAF1的重復(fù)可以導(dǎo)致Noonan綜合征;2)SNP array