高通量測(cè)序技術(shù)在骨髓增殖性腫瘤臨床檢測(cè)中的方法學(xué)建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、目的:骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)是一組起源于造血干細(xì)胞的惡性骨髓增殖性疾病，以外周血一系或多系細(xì)胞增多，易發(fā)生血栓和出血等并發(fā)癥，自發(fā)性向急性白血病和骨髓纖維化轉(zhuǎn)化為共同臨床特點(diǎn)的一類髓系增殖性疾病。
　　快速、準(zhǔn)確和全面地獲取MPN患者的DNA分子遺傳信息對(duì)于臨床研究以及指導(dǎo)臨床治療具有十分重要的意義。對(duì)于每個(gè)生物體來(lái)說(shuō)，其基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測(cè)序技術(shù)能夠真實(shí)

2、地反映患者基因組DNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較全面地揭示患者基因組DNA的復(fù)雜性和多樣性。1977年Sanger發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。Sanger測(cè)序迄今為止仍是DNA測(cè)序的主流方法，但是測(cè)序速度慢、成本高、通量小使得傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要。新一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)是一次可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條D

3、NA分子進(jìn)行序列測(cè)定的高通量測(cè)序技術(shù)。新一代測(cè)序技術(shù)具有速度快、準(zhǔn)確度高、成本低、覆蓋度深和產(chǎn)出巨大等優(yōu)點(diǎn)，研究者可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行精確定位和分析，在臨床檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用前景。Ion TorrentPGM測(cè)序儀是一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代測(cè)序技術(shù)，通過(guò)專有的大規(guī)模并行半導(dǎo)體感應(yīng)器，對(duì)于DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的離子流，實(shí)現(xiàn)直接和實(shí)時(shí)的檢測(cè)。IonTorrent技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、速度快、靈活性大等優(yōu)點(diǎn)。目前已應(yīng)用于多領(lǐng)域的研究，如

4、癌癥、遺傳疾病、婦嬰健康領(lǐng)域、血液相關(guān)疾病、微生物研究和生物學(xué)基礎(chǔ)研究等。
　　Thermo Life公司推出的AmpliSeq建庫(kù)方案，該技術(shù)僅利用20ng樣品就可在一管中同時(shí)擴(kuò)增6144種PCR片段，使科研人員能快速的分析成千上萬(wàn)個(gè)目標(biāo)基因。目前Thermo Life已推出了商業(yè)化Cancer Hotspot Panel，其中大多基因涉及的是實(shí)體腫瘤，其對(duì)血液系統(tǒng)疾病的研究還較少。Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)的可擴(kuò)展

5、性允許研究人員可以自由的選擇感興趣的幾十甚至幾百個(gè)基因定制多重PCR引物試劑盒。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)，我們定制了MPN致病相關(guān)基因的多重PCR引物試劑盒，包括JAK2、MPL、CALR、KIT、ASXL1、IDH1、IDH2、 LNK、CBL、TET2、EZH2、DNMT3A、U2AF1、SRSF2、SF3B1、CSF3R、TP53、SOCS1、SOCS2、SOCS3、NRAS、KRAS及NEF共23種基因。本課題第一部分的目的是在于研究I

6、on Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)及定制的MPN多重引物試劑盒在骨髓增殖性腫瘤臨床診斷中的方法學(xué)建立。
　　結(jié)合近年來(lái)的研究，約95％～98％的PV(Polycythemia vera)、約50％～60％的ET(Essential thrombocythemia)及PMF（Primary myelofibrosis）患者存在JAK2突變，約4％的ET患者及8％的PMF患者存在MPL突變，CALR突變?cè)赑V患者中罕見，在ET患者中

7、的突變率約為15％-24％，在PMF患者中的突變率約為25％-35％左右。然而，仍有15％的MPN病人不存在以上三種突變，此類MPN歸類于三陰性MPN。目前對(duì)于三陰性的MPN，因?yàn)槿狈θN主要的分子學(xué)突變，造成其診斷困難。本課題第二部分的目的在于研究三陰性MPN患者的分子學(xué)異常，通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)獲得三陰性MPN疾病相關(guān)基因序列信息，為臨床醫(yī)生提供診斷依據(jù)。
　　方法:
　　1、篩選目的基因、定制MPN多重PCR引物試劑盒利

8、用Ion AmpliSeq Designer引物設(shè)計(jì)工具，對(duì)通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)獲得的23個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行多重PCR引物設(shè)計(jì)，定制MPN多重PCR引物試劑盒。
　　2、DNA提取按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，提取骨髓細(xì)胞DNA。
　　3、Sanger測(cè)序用經(jīng)典的Sanger測(cè)序方法檢測(cè)MPN患者的MPL基因突變情況。
　　4、Ion Torrent PGM測(cè)序
　　1)文庫(kù)構(gòu)建檢測(cè)DNA濃度，加無(wú)酶水稀釋到10ng/

9、ul。按照試劑盒說(shuō)明書操作，擴(kuò)增目的基因DNA、消化引物、加barcode接頭、純化擴(kuò)增文庫(kù)，最后定量文庫(kù)。
　　2)模板制備分別在Ion OneTouch Two和Ion OneTouch ES儀器上進(jìn)行乳液PCR和陽(yáng)性模板富集。
　　3) Ion Torrent PGM測(cè)序?qū)⒅苽涞哪０寮又罥on316芯片上，在PGM測(cè)序儀上測(cè)序，測(cè)序原始數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在Ion Torrent PGM服務(wù)器上，用ionreporter(ionr

10、eporter.thermofisher.com)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)一步分析。
　　結(jié)果:
　　1、Ion Ampliseq Designer設(shè)計(jì)MPN多重PCR引物
　　用Ion Ampliseq Designer對(duì)23個(gè)MPN致病相關(guān)基因設(shè)計(jì)多重PCR引物，結(jié)果如下:該MPN panel大小為52.42kb，共有283個(gè)擴(kuò)增子，可以覆蓋97.28％的目標(biāo)區(qū)域，PCR擴(kuò)增在兩管內(nèi)完成，分別有145和138個(gè)擴(kuò)增子，擴(kuò)增子的

11、長(zhǎng)度在125bp和275bp之間。
　　2、Sanger檢測(cè)MPL突變情況
　　對(duì)第一部分和第二部分共20例MPN患者的MPL基因進(jìn)行Sanger測(cè)序，20例MPN患者M(jìn)PL基因突變均為陰性。
　　3、Ion Torrent PGM測(cè)序質(zhì)控
　　以一張316芯片為例，芯片中磁珠覆蓋率為66％，產(chǎn)生原始測(cè)序數(shù)據(jù)236Mb。磁珠文庫(kù)連接率為100％，其中33％磁珠連接多克隆文庫(kù)，67％磁珠連接單克隆文庫(kù)。所有單克隆文

12、庫(kù)中，除去1％測(cè)試片段，12％接頭二聚體，10％低質(zhì)量文庫(kù)，最終有效單克隆文庫(kù)為77％，有效讀取片段共2，159，538個(gè)。片段平均讀長(zhǎng)為181bp，中位讀長(zhǎng)為196bp。不同位置的堿基平均讀取準(zhǔn)確度為99.3％。其中達(dá)到AQ20(與參考序列99％匹配)標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)為207Mb。Ion TorrentPGM測(cè)序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為:磁珠覆蓋率＞60％，磁珠文庫(kù)連接率＞80％，連接多克隆文庫(kù)磁珠＜40％，測(cè)試片段＜5％。整張芯片測(cè)序質(zhì)控達(dá)到Ion T

13、orrent PGM測(cè)序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。以樣品P1為例，單個(gè)樣品測(cè)序質(zhì)控結(jié)果顯示:讀取71，322，697個(gè)堿基，能達(dá)到AQ20標(biāo)準(zhǔn)的堿基數(shù)為64，123，648，平均測(cè)序深度為1，302×。
　　4、Ion Torrent PGM測(cè)序結(jié)果分析
　　1)對(duì)10例已經(jīng)用Sanger測(cè)序法檢測(cè)JAK2、MPL和CALR三個(gè)基因的MPN患者進(jìn)行Ion Torrent PGM測(cè)序，就JAK2、MPL、CALR三個(gè)基因而言，3例CALR基因

14、52bp缺失均未被Ion Torrent PGM測(cè)序檢出，其余測(cè)序結(jié)果與Sanger測(cè)序結(jié)果完全吻合。Ion Torrent PGM測(cè)序結(jié)果可以顯示基因位置、突變類型、氨基酸的改變和測(cè)序深度，最重要的是Ion Torrent PGM測(cè)序能顯示突變所占的比例，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞負(fù)荷進(jìn)行定量。
　　2)10例三陰性MPN患者Ion Torrent PGM測(cè)序結(jié)果顯示:1例ET患者未檢測(cè)出基因突變，其余9例患者均檢測(cè)到突變，突變個(gè)數(shù)為1-3

15、個(gè)。其中最常見的為表觀遺傳修飾基因TET2突變，4例患者檢測(cè)出TET2基因突變。1例慢性中性粒細(xì)胞白血病病人檢測(cè)出CSF3RT618I突變。1例PMF患者檢測(cè)出TP53基因突變。除此之外，突變還涉及剪接體基因、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因等。
　　結(jié)論:
　　1、本研究結(jié)合自已定制的MPN多重PCR引物試劑盒和Ion Torrent PGM測(cè)序平臺(tái)，成功的建立了一套靈敏特異、快速、高通量的MPN致病相關(guān)基因突變檢測(cè)方法。Ion Torr