高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用

1、高通量測(cè)序技術(shù)在腫瘤診斷與個(gè)體化治療中的應(yīng)用,吳晨,腫瘤是一種基因病,,基因過表達(dá)與突變,,同病異突變,,傳統(tǒng)突變檢測(cè)的局限性,,NGS,測(cè)序的歷史,高通量測(cè)序:一次性對(duì)幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，又稱為下一代測(cè)序技術(shù)，其使得可對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全貌的分析，所以又被稱為深度測(cè)序。 High-throughput Sequencing Next Generation Sequencing Deep

2、 Sequencing,高通量測(cè)序簡(jiǎn)介（NGS）,,文庫擴(kuò)增,,低通量,,Sanger測(cè)序 高通量測(cè)序,并行測(cè)序高通量,,無需建立文庫，兩端加測(cè)序接頭,,PCR擴(kuò)增,,a: Roche/454, Life/APG, Polonatorb: Illumina/Solexa Solid-Phase amplificationc: Applied Biosystems SOLiD systemd: Helico

3、s Biosciences: one pass,454 測(cè)序流程,Illumina Solexa 測(cè)序流程,ABI SOLiD測(cè)序原理,三種平臺(tái)的技術(shù)差異,1.對(duì)于研究區(qū)域比較嚴(yán)格定義的時(shí)候，Agilent平臺(tái)更適合。 2.Illumina平臺(tái)能夠捕獲UTR區(qū)域，其他平臺(tái)不行。 3.Agilent能檢測(cè)到最多的SNP及插入缺失。,科研應(yīng)用（潛在臨床應(yīng)用前景）,外顯子組測(cè)序,Exome Sequencing Allows for Ra

4、pid Gene Identification in a Charcot-Marie-Tooth Family Annual Neurology冰桶挑戰(zhàn)讓我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮綜合征。全外顯子測(cè)序分析了這一罕見家系存在的基因突變類型 （罕見病家系）,,,10 HBV（+） HCC with PVTTs and matched controls,,Illumina/Solexa sequencing ABI SOLiD s

5、equencing,Identification of candidate somatic mutations.,,,Identification of somatic indels,PCR-based Sanger resequencing.,,基因組DNA打斷,,外顯子捕獲富集,,文庫建立,,測(cè)序,,原始數(shù)據(jù)下機(jī),,數(shù)據(jù)過濾質(zhì)控,,,,Shooting Gun,參考序列,,,,,無,有,Indel, SNP 統(tǒng)計(jì)氨基酸突變研究G

6、O功能分析KEGG通路分析,,,測(cè)序深度評(píng)估測(cè)序覆蓋度評(píng)估測(cè)序隨機(jī)性評(píng)估,分析內(nèi)容,測(cè)序評(píng)估,外顯子組測(cè)序,Wei X, Walia V, et al. Exome sequencing identifies GRIN2A as frequently mutated in melanoma. Nat Genet黑色素瘤發(fā)生率一直在上升，此研究對(duì)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行外顯子組捕獲測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了和其相關(guān)的高頻突變基因。（

7、某種類型疾病與暴露因素相關(guān)性研究）,基因組DNA打斷,,外顯子捕獲富集,,文庫建立,,測(cè)序,,原始數(shù)據(jù)下機(jī),,數(shù)據(jù)過濾質(zhì)控,,,,Shooting Gun,參考序列,,,,,無,有,Indel, SNP 統(tǒng)計(jì)氨基酸突變研究GO功能分析KEGG通路分析,,,測(cè)序深度評(píng)估測(cè)序覆蓋度評(píng)估測(cè)序隨機(jī)性評(píng)估,分析內(nèi)容,測(cè)序評(píng)估,,七個(gè)新發(fā)現(xiàn)的非同義高頻突變位點(diǎn),單個(gè)基因中突變位點(diǎn)分析,基因GRIN2A模式圖，箭頭表示突變位點(diǎn),What c

8、an/would we do?,基于全外顯子測(cè)序的家族遺傳性腫瘤疾病易感性研究（以下以胃癌為例）,胃癌（Gastric Cancer）全球：第四大常見癌癥；第二大癌癥死亡率 平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女發(fā)病率2:1中國(guó)：惡性腫瘤中居首位，西北與東南沿海地區(qū)發(fā)病率更高風(fēng)險(xiǎn)：家族遺傳、HP、飲食結(jié)構(gòu)、癌前胃部疾病、吸煙等家族遺傳因素：胃癌病人親屬的胃癌發(fā)病率較普通人高4倍以上

9、 10%胃癌在家族中遺傳 1%-3%為CDH1基因突變帶來的家族彌漫性胃癌，其他 原因目前未知,罕見類型或特殊病理類型！,家族性胃癌是指：高發(fā)病率區(qū)(如中國(guó))一級(jí)和(或)二級(jí)親屬中≥3例患病其中1例是另2例的一級(jí)親屬連續(xù)兩代發(fā)病至少有1例發(fā)病年齡＜50歲。,突破點(diǎn)在于：1、發(fā)現(xiàn)罕見疾病家系

10、2、收集完整家族血液樣本3、剔除抑制突變、SNP及同義突變4、發(fā)現(xiàn)新的突變>SNP>copy number,肥胖與HP（+）胃癌的關(guān)系研究,胃癌（Gastric Cancer）全球：第四大常見癌癥；第二大癌癥死亡率 平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女發(fā)病率2:1中國(guó)：惡性腫瘤中居首位，西北與東南沿海地區(qū)發(fā)病率更高風(fēng)險(xiǎn)：家族遺傳、HP、飲食結(jié)構(gòu)、癌前胃部疾病、吸煙等家族遺傳因素

11、：肥胖和腫瘤是全球兩大重要的公共衛(wèi)生問題。 肥胖可以增加胃癌罹患率,并且治療效果差、 腫瘤病死率高,但具體機(jī)制尚不清楚。 肥胖與胃癌均存在一定家族遺傳性,,,,,全外顯子捕獲測(cè)序獲得初篩數(shù)據(jù),,,,Step 2,Step 3,先證者,母親,父親,DNA/RNA Extraction,

12、Next-generation Sequencing,,,,,數(shù)據(jù)庫比對(duì),,,,SNV、indel analysis、mutant genes,,,,,,,,,RT-PCR、IHC of target genes in tissues of proband,功能研究,Blood Samples,,,,,,In vitro/ vivo study,5 Trios with HP（+）,,Tissues,TRIO家庭三口之家,肥胖的定義,

13、1.BMI: 30kg/㎡ obesity,2.WHR or WHtR（waist-to-hip ratio or waist-to height ratio Male： >0.95 obesity Female：>0.8 obesity,三人同時(shí)滿足！,HP（+）的定義,胃鏡取活檢標(biāo)本檢查，分離培養(yǎng)+直接涂片檢查+病理切片

14、未經(jīng)任何治療,胃癌的定義,胃鏡取活檢標(biāo)本檢查，病理檢測(cè)未經(jīng)任何治療腺癌(包括乳頭狀腺癌、管狀腺癌、粘液腺癌、印戒細(xì)胞癌),先證者一人滿足！,C14呼氣試驗(yàn)?zāi)芊翊_診HP（+）？,實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組,3-5 TRIOs,肥胖家庭,非肥胖家庭,HP（+）,外顯子測(cè)序,普通測(cè)序驗(yàn)證,De Novo 突變,體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn),,,,,,,3-5 TRIOs,HP（+）,外顯子測(cè)序,普通測(cè)序驗(yàn)證,De Novo 突變,體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn),,,,,,,

15、其他標(biāo)準(zhǔn)：性別比 TNM 分期 先證者年齡,質(zhì)控,標(biāo)本采集：TRIO全血采集（與測(cè)序公司討論所需血樣體積），采用抗凝管DNA提?。≦IAmp DNA Blood Mini kit）及保存 （1）樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.8～2.0 之 間；RNA free。 （2）樣品濃度：最低濃度不低于50ng/µl。 （3）樣品總量：每個(gè)樣品總量不少于15µg。 （4）樣品溶劑：溶解在H20

16、或TE （pH 8.0）中。 （5）保存：DNA低溫運(yùn)輸（-20℃，干冰）,臨床應(yīng)用,基于測(cè)序的腫瘤個(gè)人疾病ID建立與個(gè)體化治療方案,癌癥突變用藥數(shù)據(jù)庫,其他優(yōu)勢(shì),數(shù)萬份案例臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫NCCN及FDA數(shù)據(jù)庫結(jié)合人群用藥情況（中國(guó)）專人監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)更新,血液樣本監(jiān)測(cè)遺傳信息監(jiān)測(cè)二/三期臨床藥物推薦,私人訂制！,石蠟包埋組織切片或組織塊新鮮冰凍組織血液和骨髓其他,,檢測(cè)流程,,CDK,,,,VEGF,損傷修復(fù)基