建立一種快速檢測(cè)NF-κB活性的酶標(biāo)方法.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)從人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR方法得到人NF-κB P50全長(zhǎng)基因(長(zhǎng)1308bp，編碼436個(gè)氨基酸)；構(gòu)建了重組表達(dá)載體pGEX-4T-P50；轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，在30℃，IPTG終濃度為0.2mM，誘導(dǎo)6hr，獲得融合蛋白GST-P50(分子量約70kD)，表達(dá)量占菌體總蛋白的30％，可溶性融合蛋白為總?cè)诤系鞍椎?/5；純化融合蛋白并免疫家兔獲得了多克隆抗體，抗體經(jīng)純化并分裝保存；Western印跡

2、分析表明純化后的多克隆抗體中已經(jīng)無(wú)針對(duì)GST蛋白的抗體，而只具有較強(qiáng)的專一于P50蛋白的抗體；ELISA分析證實(shí)其效價(jià)為5×105。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的酶標(biāo)檢測(cè)方法，經(jīng)過(guò)摸索并確定了：GST-P50包被濃度為1μg/ml、包被體積為100μl，抗體的稀釋度為1/1600，抗體與核蛋白樣品的溫育條件為37℃1hr，此時(shí)檢測(cè)NF-κB活性的靈敏度最高，可達(dá)到ng級(jí)，足以檢測(cè)出細(xì)胞中NF-κB活性的微量變化。 進(jìn)一步利用檢測(cè)模型來(lái)驗(yàn)

3、證此酶標(biāo)方法的優(yōu)劣，實(shí)驗(yàn)組加入了100ng/mlLPS刺激U251細(xì)胞30min，細(xì)胞中NF-κB的活性就顯著增高，1hr達(dá)到峰值，然后開(kāi)始下降，6hr已經(jīng)處于低水平的維持狀態(tài)；當(dāng)刺激時(shí)間同樣維持在1hr，LPS的濃度分別為10ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、60 ng/ml、100 ng/ml時(shí)，細(xì)胞中NF-κB的活性隨劑量的增加而增高，用我們的酶標(biāo)方法得到的檢測(cè)結(jié)果(細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性變化趨勢(shì))與Wang X的報(bào)道