利用Hi-C技術(shù)高通量篩選介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用的lncRNAs.pdf

1、細(xì)胞核是真核生物特有的，最大的細(xì)胞器。染色質(zhì)是遺傳和表觀遺傳信息的載體，并且是最大的生物大分子。大約2m長的染色質(zhì)被折疊進直徑小于10μm的細(xì)胞核。染色體構(gòu)象捕獲（3C）技術(shù)以及一系列它的衍生技術(shù)（4C、5C、Hi-C）的發(fā)展促進了核結(jié)構(gòu)的研究。這些技術(shù)揭示了一些蛋白如CTCF，Cohesin等在染色質(zhì)折疊和相互作用中發(fā)揮重要的作用。最近發(fā)現(xiàn)一些lncRNAs也參與了染色質(zhì)的相互作用。lncRNAs通過與DNA、蛋白質(zhì)，甚至與RNA本身

2、相互作用，參與了染色質(zhì)相互作用并調(diào)控了核結(jié)構(gòu)的形成，比如XIST,Firre等。因為基因組的大部分編碼為ncRNA，我們猜測也許很多l(xiāng)ncRNA參與了核結(jié)構(gòu)的調(diào)控。但是直到現(xiàn)在，也沒有任何系統(tǒng)的關(guān)于lncRNA參與染色質(zhì)相互作用的報道。
　　為了在全基因組范圍內(nèi)篩選可能參與染色質(zhì)相互作用的lncRNAs，我們建立了一種基于Hi-C技術(shù)的高通量篩選的方法，它是通過對比RNase處理前后基因組范圍的染色質(zhì)相互作用來實現(xiàn)的。建立高質(zhì)量的

3、Hi-C文庫是整個課題的關(guān)鍵。Hi-C技術(shù)是一個多步驟、耗時較長的分子生物學(xué)技術(shù)，需要多種試劑和儀器。這個技術(shù)還不是很成熟，到現(xiàn)在為止它的重復(fù)性還不是很好很穩(wěn)定。通過優(yōu)化復(fù)雜的Hi-C實驗中最核心的步驟如交聯(lián)、酶切、限制性內(nèi)切酶的失活和原位連接等，我們建立了一個成熟的、穩(wěn)定的Hi-C建庫流程。在初始Hi-C文庫進行擴增之后，將GM12878細(xì)胞的RNase處理前后的兩組生物學(xué)重復(fù)Hi-C文庫進行了高通量測序。在初步的生物信息學(xué)分析之后，

4、文庫的質(zhì)量及生物學(xué)重復(fù)的重復(fù)性得到檢驗。平均來說，原始數(shù)據(jù)中大概有90％的比對率，72%的配對率。
　　此外，在去除自連片段和dangling-ends后，能夠獲得超過96%的有效相互作用對。相關(guān)性分析顯示，兩組生物學(xué)重復(fù)的bincoverage和allbinpairs的相關(guān)性都極強。所有這些結(jié)果進一步證明了優(yōu)化了的Hi-C建庫流程是可靠并且穩(wěn)定的。在獲得了高質(zhì)量并且高度重復(fù)性的文庫后，我們進一步對照分析了RNase處理前后樣品文

5、庫的結(jié)果。對比分析顯示，在RNase處理之后很多相互作用減弱甚至是消失了。
　　在建庫過程中也發(fā)現(xiàn)，和RNase處理組相比，同樣細(xì)胞量的正常組得到了1.58倍的初始Hi-C文庫（相互作用片段）。在兩組生物學(xué)重復(fù)的正常組和RNase處理組扣減后，我們選擇正值前10000對差異相互作用進行下一步的分析。最后發(fā)現(xiàn)在RNase處理后消失或減弱的染色質(zhì)相互作用位點附近存在4081個lncRNAs編碼基因。GO注釋顯示，這4081個lncRN