染色質(zhì)免疫沉淀（chip）實(shí)驗(yàn)指南及技術(shù)總結(jié)

1、染色質(zhì)免疫沉淀（染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)指南及技術(shù)總結(jié)）實(shí)驗(yàn)指南及技術(shù)總結(jié)ChIP是一項(xiàng)比較流行的研究轉(zhuǎn)錄因子（tranionfactTF）與啟動(dòng)子（promoter）相互結(jié)合的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。由于ChIP采用甲醛固定活細(xì)胞或者組織的方法，所以能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況。這個(gè)優(yōu)勢(shì)是EMSA這個(gè)體外研究核酸與蛋白相互結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法所不能比擬的。當(dāng)用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之

2、間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合（生物意義上的結(jié)合）時(shí)，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。一般ChIP的流程是：甲醛處理細(xì)胞——收集細(xì)胞，超聲破碎——加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白DNA復(fù)合物相互結(jié)合——加入ProteinA，結(jié)合抗體靶蛋白DNA復(fù)合物，并沉淀——對(duì)沉淀下來(lái)的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合——洗脫，得到富集的靶蛋白DNA復(fù)合物——解交聯(lián)，純化富集的

3、DNA片斷——PCR分析。在PCR分析這一塊，比較傳統(tǒng)的做法是半定量－PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來(lái)越傾向于Q－PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來(lái)的方法。例如RIP（其實(shí)就是用ChIP的方法研究細(xì)胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合，具體方法和ChIP差不多，只是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意防止RNase，最后分析的時(shí)候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）；還有ChIPchip（其實(shí)就是ChIP富集得到的DNA片段，拿去做芯片分析，

4、做法在ChIP的基礎(chǔ)上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據(jù)公司的要求來(lái)準(zhǔn)備樣品）。第一天：（一）、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。1、取出1平皿細(xì)胞（10cm平皿），加入243ul37％甲醛，使得甲醛的終濃度為1％。（培養(yǎng)基共有9ml）2、37攝氏度孵育10min。3、終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125M。450ul2.5M甘氨酸于平皿中?；靹蚝?，在室溫下放置5min即可。4、吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。5、細(xì)胞刮刀收集細(xì)

5、胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預(yù)冷后2000rpm5min收集細(xì)胞。6、倒去上清。按照細(xì)胞量，加入SDSLysisBuffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2106個(gè)細(xì)胞。這樣每100ul溶液含1106個(gè)細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。第三天：（一）、DNA樣品的回收17、解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37度孵育1h。18、每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HC

6、l（PH6.5），2ul10mgml蛋白酶K。45度處理2h。19、DNA片段的回收―――omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100ulddH2O。（二）、PCR分析二、技術(shù)總結(jié)（一）、關(guān)于細(xì)胞細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)要好。因?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響細(xì)胞內(nèi)部的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也很有可能影響你所研究的TF與其靶Promoter的結(jié)合。一般細(xì)胞長(zhǎng)到75％－80％比較好。（二）、關(guān)于抗體！抗體是實(shí)驗(yàn)成敗的致命因素之一！必須是IP級(jí)別的抗體，另外如果

7、經(jīng)濟(jì)條件許可的話，盡量買大廠的抗體。不推薦國(guó)產(chǎn)抗體和santacruz的抗體，即使是IP級(jí)別的。單抗與多抗的選擇也需要仔細(xì)考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強(qiáng)，背景低。但是單抗有一個(gè)致命的弱點(diǎn)，就是識(shí)別位點(diǎn)單一，而在ChIP甲醛交聯(lián)的過(guò)程中，很有可能該位點(diǎn)被其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識(shí)別靶蛋白。多抗雖然沒有這個(gè)問(wèn)題，但是多抗特異性較差，背景可能會(huì)偏高。一般而言，如果沒有十足把握（單抗的識(shí)別位點(diǎn)遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域），

8、選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。（三）、關(guān)于交聯(lián)與超聲破碎！這一塊的確是ChIP實(shí)驗(yàn)中比較難把握的部分。交聯(lián)的程度會(huì)影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)的程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段。交聯(lián)不充分，只有一部分靶蛋白與其Promoter相結(jié)合，富集得到的Promoter的量不高，實(shí)驗(yàn)假陰性。交聯(lián)過(guò)充分，基因組上結(jié)合了太多的蛋白，對(duì)超聲破碎造成障礙。另外也會(huì)增加背景。一般來(lái)講，按照我的經(jīng)驗(yàn)，交聯(lián)條件取決于細(xì)胞類型。不同的細(xì)胞系，交聯(lián)的條件也不一