RNAi-Ly49C誘導(dǎo)KIR錯配增強Allo-NK細胞GVL效應(yīng).pdf

1、研究背景與目的：
　　 異基因造血干細胞移植是治療惡性血液病的有效手段，但是，對于高度危險型白血病，Allo-HSCT后復(fù)發(fā)率仍然高達81％。如何提升GVL效應(yīng)，降低移植后復(fù)發(fā)率是提升高度危險型白血病治療效果的關(guān)鍵所在。
　　 Allo-HSCT中，同種異體反應(yīng)性自然殺傷細胞因具有對惡性細胞殺傷的高效性和對受者正常細胞的低損傷性，是GVL效應(yīng)的重要效應(yīng)細胞。
　　 NK細胞的效應(yīng)發(fā)揮受HLA-KIR等抑制性信號和

2、NKG2DL-NKG2D等活化性信號共同調(diào)節(jié)，二者對沖后的優(yōu)勢信號決定NK細胞的功能狀態(tài)。單倍體相合移植中，HLA單倍體相合供者NK細胞表面的KIR和與受者靶細胞表面的HLA分子結(jié)合，可傳遞殺傷抑制信號，抑制了NK細胞對靶細胞的殺傷。針對這一靶點，本研究采用封閉供者NK細胞抑制性KIR表達的方法，人工誘導(dǎo)KIR錯配，減少對NK細胞殺傷活性的抑制，以其提升NK細胞抗白血病效應(yīng)。
　　 實驗方法：
　　 第一部分Ly49-H

3、-2信號系統(tǒng)調(diào)控NK細胞對腫瘤細胞殺傷效應(yīng)的體外研究
　　 以Balb/C(H-2d)×C57BL/6(H-2b)雜交F1代(H-2d/b小鼠脾單個核細胞作為NK細胞來源，MACS陽選得DX5+NK細胞。流式細胞儀(Flow cytometry,FCM)檢測NK細胞純度和編輯前、后NK細胞表面Ly49表達。常規(guī)培養(yǎng)NK細胞敏感靶細胞YAC-1，LDH釋放法用于檢測NK細胞對其殺傷活性。以C57BL/6鼠源性紅白血病細胞株FBL-

4、3為靶，LDH釋放法檢測未處理NK細胞組(編輯前NK細胞組)、抗體阻斷NK細胞組(14B11單抗與NK細胞共孵育)、編輯后NK細胞組(效靶細胞10∶1共孵育24h)和抗體阻斷編輯后NK細胞組對其殺傷活性。
　　 第二部分 RNAi-Ly49對NK細胞體外殺傷腫瘤細胞效應(yīng)的影響
　　 F1代鼠NK細胞分離純化同第一章，編號為124，335，589，91的四條siRNAoligo轉(zhuǎn)染NK細胞，F(xiàn)CM檢測干擾后各組NK細胞Ly

5、49C表達以篩選有效siRNAoligo。選取最高抑制組NK細胞，LDH釋放法檢測其對YAC-1和FBL-3細胞殺傷活性。
　　 第三部分 RNAi-Ly49對單倍體相合移植模型中NK細胞GVL效應(yīng)的影響雌性荷白血病C57BL/6鼠為受者，雄性CB6F1小鼠為供者，進行骨髓移植。受鼠隨機分為5組，每組10只。移植組在9Gy照射后行F1到C57移植構(gòu)建單倍體相合小鼠移植模型，觀察GVL效應(yīng)。
　　 A組，未處理白血病組

6、r>　　 B組，單純照射組
　　 C組，照射后單純移植組，輸注骨髓細胞1×107/只
　　 D組，照射后移植骨髓細胞和未處理NK細胞，照射后1h輸注未處理F1代鼠NK2×106/只，4h后輸注F1代鼠骨髓細胞1×107/只
　　 E組，照射后移植骨髓細胞和RNAi-Ly49處理后NK細胞，照射后1h輸注siRNA轉(zhuǎn)染后F1代鼠NK2×106/只，4h后輸注F1代鼠骨髓細胞1×107/只。
　　 統(tǒng)計學(xué)方

7、法
　　 本實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，以均值±標準差(x±S)表示，所用統(tǒng)計方法主要包括單向方差分析、獨立樣本t檢驗、生存曲線以Kaplan-Meier法制作，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分 Ly49-H-2信號系統(tǒng)調(diào)控NK細胞對腫瘤細胞殺傷效應(yīng)
　　 1，分選所得NK細胞殺傷活性測定
　　 以小鼠NK細胞的敏感細胞株YAC-1為靶細胞，分選

8、得F1代NK細胞的殺傷活性隨效靶比升高而增強，NK細胞的殺傷活性正常。5∶1時(24.80±0.85)％，10∶1時為(45.95±2.09)％，20∶1時為(60.71±1.04)％，40∶1時為(79.54±0.94)％。
　　 2，各組NK細胞對腫瘤細胞殺傷效應(yīng)檢測
　　 以C57BL/6鼠源性紅白血病細胞FBL-3為靶，各組NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性經(jīng)單向方差分析，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=228.390，

9、P=0.000)。以未處理NK細胞組殺傷效應(yīng)(20.57±1.22)％為基線數(shù)據(jù)，抗體阻斷NK細胞組殺傷效應(yīng)與之相比顯著增強(P=0.000)，編輯后NK細胞組殺傷效應(yīng)與之相比顯著減弱(P=0.000)。FCM測得編輯后NK細胞組Ly49C(C57BL/6鼠KIR)表達率為(84.98±1.25)％，與未處理組NK(52.27±2.57)％相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=22.927，P=0.000)。抗體阻斷編輯后NK細胞組殺傷效應(yīng)與編輯

10、后NK細胞組相比，顯著增強(P=0.000)。
　　 結(jié)果顯示，Allo-NK細胞可以殺傷YAC-1和FBL-3細胞，二者對效應(yīng)細胞的敏感程度不同。NK細胞的活化狀態(tài)由抑制性信號和活化性信號的強度共同決定。腫瘤細胞編輯誘導(dǎo)KIR(Ly49)表達上調(diào)可降低NK細胞殺傷活性，以單克隆抗體14B11阻斷Ly49抑制性信號通路，促進了對沖信號向激活性信號的偏移，增強了NK細胞對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)。
　　 第二部分 RNAi-Ly

11、49影響NK細胞體外殺傷腫瘤細胞效應(yīng)
　　 1，轉(zhuǎn)染后各組NK細胞的Ly49C表達
　　 轉(zhuǎn)染編號為124、335、91、589的siRNA序列，轉(zhuǎn)染后48h FCM檢測NK細胞的Ly49C表達率，分別為(27.48±2.79)％，(52.73±2.14)％，(40.98±4.29)％，(33.26±2.77)％。
　　 2，siRNA干擾后NK細胞對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)
　　 以編號為124的siRNA序

12、列的抑制率最高，達48％。干擾后NK細胞對YAC-1細胞殺傷活性為(58.77±1.60)％(E∶T=20∶1)，與未處理組(60.71±1.04)％相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(t=1.757，P=0.154)。干擾后NK細胞對FBL-3細胞的殺傷活性達(29.08±2.91)％，與未處理組(20.57±1.22)％相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.664，P=0.010)。
　　 結(jié)果顯示，體外實驗，轉(zhuǎn)染后NK細胞對YAC-1細胞殺

13、傷功能與未處理組NK細胞相比無顯著性差異，結(jié)果和YAC-1細胞來源品系A(chǔ)/Sn與CB6F1小鼠完全錯配相吻合。單倍體相合的FBL-3細胞則顯示不同情況，轉(zhuǎn)染后NK細胞KIR表達下調(diào)，使NK細胞偏向活化的功能狀態(tài)，提高了其對FBL-3細胞的殺傷效應(yīng)。
　　 第三部分 RNAi-Ly49影響單倍體相合移植模型中NK細胞GVL效應(yīng)實驗各組小鼠存活狀態(tài)觀察
　　 A組未作處理，白血病進展迅速，小鼠全部于8-11天死亡，生存時間(

14、9.43±1.06)d
　　 B組照射后未做移植，小鼠體重迅速下降，生存時間(9.23±0.40)d，均死于造血衰竭(WBC＜0.5×109/L)
　　 C組2只存活超過30天，生存時間(23.88±8.65)d。
　　 D組4只存活超過30天，生存時間(30.14±8.56)d，對照未處理組，抑制率=319.62％；對照單純移植組，抑制率=126.21％。
　　 E組5只存活超過30天，生存時間(33.

15、74±6.71)d，對照未處理組，抑制率=357.79％；對照單純移植組，抑制率=141.29％。
　　 結(jié)果顯示，在荷白血病小鼠模型觀察NK細胞的抗腫瘤效應(yīng)，以生存期為觀察指標推算抑制率，設(shè)未處理的A組為對照，E組抑制率為357.79％，高于D組38.17％；設(shè)未輸注NK細胞的C組為對照，D組抑制率為126.21％，E組抑制率高過D組15.08％，達141.29％。說明通過人工誘導(dǎo)KIR錯配的方法提高單倍體相合KIR的錯配率，

16、進一步提升了NK細胞的GVL效應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外功能實驗，效應(yīng)細胞NK的活化狀態(tài)由抑制性信號和活化性信號的強度共同決定。以單克隆抗體14B11阻斷Ly49表達和RNAi-Ly49干擾抑制性信號通路傳導(dǎo)，促進了對沖信號向激活性信號的偏移，增強了NK細胞對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)。
　　 2.體內(nèi)實驗，荷白血病小鼠模型觀察NK細胞的抗腫瘤效應(yīng)，以生存期為觀察指標推算抑制率：設(shè)未處理的A組為對照，E組抑制率為

17、357.79％，高于D組38.17％；設(shè)未輸注NK細胞的C組為對照，D組抑制率為126.21％，E組抑制率高過D組15.08％，達141.29％。說明通過人工誘導(dǎo)KIR錯配的方法提高單倍體相合KIR的錯配率，提升了NK細胞的抗腫瘤效應(yīng)。
　　 本研究的創(chuàng)新點：理論方面，提出通過阻斷供者NK細胞KIR(Ly49)的表達，模擬臨床的KIR錯配，誘導(dǎo)供者NK細胞對受者的殺傷作用，以增強NK細胞抗腫瘤效應(yīng)，降低白血病移植后復(fù)發(fā)率。實驗方

18、法方面，采用的移植模式為F1(C57B/6×BALB/c)(H-2b/d，Ly49A+Ly49C+)向C57BL/6小鼠(H-2b，Ly49C+)骨髓移植，其中Ly49A+Ly49C+的供者NK細胞，在阻斷Ly49C表達后，保留Ly49A的表達，可以識別自身的H-2d，從而在誘導(dǎo)供者NK細胞對受者白血病細胞和骨髓細胞殺傷的同時，保留對自身耐受，以保證供者細胞能順利植入、實現(xiàn)造血重建。
　　 研究價值：本研究為提升NK細胞的抗腫瘤