NK細胞調(diào)控LPS誘導的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥.pdf

1、目的：
　　本實驗以腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的C57BL/6小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥為模型，通過抗體清除外周及腦內(nèi)浸潤的自然殺傷細胞(Natural killer cells，NK)，檢測NK細胞在神經(jīng)炎癥中對小膠質(zhì)細胞活化和炎癥細胞浸潤的影響，以探討NK細胞在LPS誘導的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中的作用。
　　方法：
　　1、動態(tài)觀察和監(jiān)測LPS處理不同時間點小鼠體重，繪制體重變化曲線以確定系

2、統(tǒng)性炎癥的變化。于LPS或PBS處理兩次時同時尾靜脈注射4％ Evans Blue200ul，次日用1％戊巴比妥鈉100ul麻醉小鼠，待其深入麻醉時用冰PBS心臟灌注，取腦觀察Evans Blue是否浸潤腦組織。正常情況下由于血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的存在，Evans Blue不能進入腦組織，若BBB的完整性遭到損傷或者BBB通透性增加時，Evans Blue會經(jīng)外周血液循環(huán)浸潤到腦內(nèi)。以此來探討LPS

3、誘導的系統(tǒng)性炎癥能否夠引起B(yǎng)BB的破壞。
　　2、免疫熒光抗體標記腦單細胞后，流式分析NK細胞及其他炎癥細胞向CNS的浸潤，同時用免疫熒光檢測腦組織小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)，以此來探討LPS能否引起CNS的炎癥反應。
　　3、用抗NK抗體(PK136)清除外周NK細胞，清除NK細胞后用LPS處理三次，LPS20微克/只/天（以下稱為LPS+PK136組），并于每次LPS處理時檢測小鼠體重。用流式分析CNS中浸潤免疫細胞的變化，同

4、時免疫熒光檢測PBS組、LPS組和LPS+PK136組腦組織小膠質(zhì)細胞Iba1的表達情況和腦組織炎性因子mRNA的表達水平。
　　4、為了解NK細胞在LPS誘導的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中的細胞學機制，動態(tài)檢測LPS處理不同時間點NK細胞及其他免疫細胞向CNS的浸潤，用抗NK抗體預先清除外周NK細胞后進而LPS處理，流式檢測浸潤的中性粒細胞和單核細胞的變化。
　　結果：
　　1、LPS處理后小鼠體重逐步減輕，于第二、三天降至最低，

5、隨后又呈上升趨勢，故本實驗采用LPS處理二天或三天炎癥較重時進行檢測。經(jīng)4％ Evans Blue處理后發(fā)現(xiàn)LPS組的腦組織被染料著色，而PBS組腦組織基本上沒有顏色變化，說明BBB的完整性遭到破壞。此實驗證明LPS誘導系統(tǒng)性炎癥的同時也引起了BBB通透性的增加，提示外周的免疫細胞可能會浸潤到CNS中。
　　2、在腦組織流式分析中發(fā)現(xiàn)LPS處理后CNS中有大量白細胞浸潤，包括NK細胞、中性粒細胞和單核細胞顯著增加，提示此時CNS內(nèi)

6、發(fā)生了炎癥反應。腦組織免疫熒光Iba1染色發(fā)現(xiàn)LPS組較PBS組小膠質(zhì)細胞明顯活化。此外，腦組織mRNA檢測發(fā)現(xiàn)LPS組比PBS組IL-1表達水平顯著性增加。此實驗說明腹腔注射LPS誘導系統(tǒng)性炎癥的同時也引起了神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥。
　　3、預先清除NK細胞后進而LPS腹腔注射，發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)浸潤的炎癥細胞較未清除NK組顯著性降低，小膠質(zhì)細胞活化明顯減輕，體重顯著性增加，IL-1表達也顯著性降低。此實驗提示NK細胞在LPS誘導的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中

7、可能起促炎作用。
　　4、在LPS誘導的神經(jīng)炎癥模型中，CNS中NK細胞的浸潤早于中性粒細胞。預先清除NK細胞后CNS中浸潤的中性粒細胞和單核細胞顯著性降低。此實驗說明在LPS誘導的神經(jīng)炎性模型中，浸潤的NK細胞可能通過吸引外周中性粒細胞和單核細胞進而促進CNS的炎癥反應。
　　結論：
　　腹腔注射LPS引起全身系統(tǒng)性炎癥的同時也可以誘導神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥，伴隨大量免疫細胞的浸潤，清除其中的NK細胞導致神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥減輕