冬凌草甲素誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)其被激活的Allo-PBMCs殺傷敏感性.pdf

1、研究背景與目的：
　　 多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害人類身體健康。目前MM的治療主要有化學(xué)治療、自體造血細(xì)胞移植和異基因造血干細(xì)胞移植等。傳統(tǒng)化療雖然能延長患者的中位生存期,但化療藥物本身對機(jī)體造成的副反應(yīng),以及患者原發(fā)/繼發(fā)耐藥等都給傳統(tǒng)化學(xué)療法的使用帶來了一定障礙。相對于傳統(tǒng)化療,大劑量化療聯(lián)合自體干細(xì)胞移植能夠延長患者中位生存期,異基因造血干細(xì)胞移植能夠發(fā)揮移植物

2、抗骨髓瘤效應(yīng),但同時異基因移植也伴隨有更高的移植物相關(guān)死亡率。因此,需尋找新的藥物和治療手段提高M(jìn)M的療效。
　　 冬凌草甲素(Oridonin,Ori)是一種從植物冬凌草中提取的四環(huán)二萜類化合物,具有廣泛的生物學(xué)、藥學(xué)和病原學(xué)功效,如抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等。國內(nèi)的應(yīng)用表明,在食管癌、胃癌或肝癌等疾病中,Ori能夠延緩疾病進(jìn)展,降低腫瘤負(fù)荷,減少并發(fā)癥同時延長患者生存期。近來研究顯示,Ori可以誘導(dǎo)包括前列腺癌、乳腺癌、非

3、小細(xì)胞肺癌、急性白血病(NB4、HL-60細(xì)胞)、多形性惡性膠質(zhì)瘤以及人類黑素瘤在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外,冬凌草甲素尚能延長荷淋巴細(xì)胞白血病P388細(xì)胞小鼠的生存期。盡管大量的研究均證明caspase 3、caspase 8、p53、Bcl-2/Bax、細(xì)胞色素c和核因子kappa B(NF-κB)等信號分子涉及到了Ori誘導(dǎo)的凋亡過程,但其對MM的抗腫瘤機(jī)制仍然未完全明了,此外,Ori的臨床應(yīng)用也仍需更進(jìn)一步的深入研究探討。

4、>　　 自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)是遺傳性免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,對病源感染和轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞具有自然細(xì)胞毒效應(yīng)。異基因造血干細(xì)胞移植中,同種異體反應(yīng)性NK細(xì)胞(Allo-reactive Natutal Killer cell,Allo-NK)能夠提升惡性血液病治愈率。NK 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞受HLA-KIA等抑制性信號和NKG2D配體-NKG2D等活化性信號的共同調(diào)節(jié)。但Allo-NK細(xì)胞對MM的作用尚待研究。
　　 依據(jù)MM的起

5、源、病因、發(fā)病機(jī)理等,認(rèn)為冬凌草甲素將會誘導(dǎo) ARH-77細(xì)胞凋亡,并推斷Ori能提升腫瘤細(xì)胞對NKG2D+細(xì)胞的殺傷敏感性。本研究以人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77細(xì)胞為研究對象,探討冬凌草甲素的體內(nèi)、體外抗腫瘤效應(yīng)。為進(jìn)一步的多靶干預(yù)治療和臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 第一章 冬凌草甲素誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77細(xì)胞凋亡
　　 以MTT的方法檢測不同濃度冬凌草甲素在不同時間對 ARH-

6、77細(xì)胞的抑制作用。經(jīng)不同濃度Ori(0、2.5、5、10μmol/L)作用24h后觀察以下指標(biāo):采用相差顯微鏡和Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期、線粒體膜電位、細(xì)胞表面TRAIL受體/Fas/FasL、細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的改變；以甲基纖維素半固體培養(yǎng)法測定ARH-77細(xì)胞在藥物干預(yù)前后的體外克隆形成能力和Ori 對人臍血單個核細(xì)胞克隆形成的影響；RT-PCR測定ARH-77細(xì)胞凋亡

7、通路調(diào)節(jié)分子Bcl-2、Bcl-x1、Bax、Bid、p53、NF-κB和β-actin的mRNA表達(dá)；分光光度法檢測caspase 8、caspase 9的變化；ELISA法檢測細(xì)胞色素c含量的變化。
　　 第二章 冬凌草甲素作用后ARH-77細(xì)胞對NKG2D+細(xì)胞殺傷敏感性的研究
　　 ARH-77細(xì)胞經(jīng)5μmol/L Ori處理24h,以LDH釋放法測定Ori作用前、后ARH-77細(xì)胞對NKG2D+細(xì)胞殺傷敏感性的

8、差異；RT-PCR方法檢測活化性受體NKG2D的配體MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3在腫瘤細(xì)胞mRNA的表達(dá)；流式細(xì)胞儀測定ARH-77細(xì)胞表面NKG2D配體(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3)、Fas/FasL/TRAIL的表達(dá)狀態(tài)。
　　 第三章 冬凌草甲素對荷人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞裸鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 選用Bul B/C nu/nu裸鼠為實(shí)驗(yàn)動物,通過尾靜脈注射ARH-7

9、7細(xì)胞建立荷人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以一般狀況、病理學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測小鼠組織形態(tài)學(xué)和人特異性CD20、CD45抗原的表達(dá),以評價(jià)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒?。給予治療組小鼠腹腔注射冬凌草甲素(15mg/kg),PBS治療作為對照組,以上述指標(biāo)和TUNEL法觀察藥物治療效果。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差9((x)±s)表示,所有統(tǒng)計(jì)方法主要包括單因素方差分

10、析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、析因設(shè)計(jì)的方差分析、重復(fù)測量的方差分析、Kaplan-Meier生存分析法。方差齊時組間多重比較采用SNK法,方差不齊時組間多重比較采用Dunnett's T3法,P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 1.冬凌草甲素能夠誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤 ARH-77細(xì)胞凋亡,其誘導(dǎo)ARH-77細(xì)胞凋亡呈時間劑量依賴性；
　　 2.冬凌草甲素誘導(dǎo)ARH-77細(xì)胞凋亡是通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員