NK細(xì)胞恢復(fù)及KIR基因分型在allo-HSCT中臨床意義研究.pdf

1、目的：研究異基因造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）后自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）恢復(fù)情況，分析供受者NK細(xì)胞表面殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）基因型與 allo-HSCT后急性移植物抗宿主病（acute graft versus host

2、disease，aGVHD）發(fā)生率、總生存率（overall survival，OS）等臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。為臨床預(yù)防GVHD和選擇合適供者提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.選擇2014年2月至2015年12月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科進(jìn)行allo-HSCT的38例患者作為研究對(duì)象。
　　2.患者的臨床情況
　　2.1 NK細(xì)胞恢復(fù)檢測(cè)患者臨床情況：①年齡：中位年齡31.5歲（3-56歲）；男性17例，女性2

3、1例。②疾病診斷及分期：急性白血病(AL)22例，其中第1次完全緩解（CR1）期16例，≥CR2期5例，NR1例。骨髓增生異常綜合征（MDS）患者6例，其中MDS-RAEBⅠ4例，MDS-RAEBⅡ2例， IPSS-R分期：均為高危；未緩解。T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤2例。重型再生障礙性貧血（SAA）7例。不典型慢性粒細(xì)胞白血?。╝CML）1例。③研究截止時(shí)間（2015-12-31）。④供受者HLA配型：HLA10/10相和非血緣相關(guān)供者（MU

4、D）移植2例，HLA10/10相合親緣供者（MSD）17例，親緣單倍體供者（haplo-HSCT）19例。⑤移植方式：非血緣供者采用外周干細(xì)胞，親緣供者采用骨髓+外周干細(xì)胞（31/36例）/外周干細(xì)胞（5/36例）。⑥對(duì)照組：造血干細(xì)胞健康供者25例。⑦回輸細(xì)胞數(shù)：MNC5.84±1.36*10^8/kg，CD34+7.03±3.62*10^6/kg(受者體重)。
　　2.2 KIR基因研究患者臨床情況：①年齡：中位年齡為32.5

5、歲（3-52歲）；男性14歲，女性14歲。②疾病診斷及分期：AL17例，MDS4例，T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤1例，SAA5例，aCML1例。③供受者HLA配型：HLA10/10相和非血緣相關(guān)供者（MUD）移植2例，HLA10/10相合親緣供者（MSD）10例，親緣單倍體供者（haplo-HSCT）16例。④移植方式：非血緣供者采用外周干細(xì)胞，親緣供者采用骨髓+外周干細(xì)胞（21/26例）/外周干細(xì)胞（5/26例）。⑤回輸細(xì)胞數(shù)：MNC6.17±

6、1.31*10^8/kg， CD34+7.64±3.28*10^6/kg（受者體重）。
　　2.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)：①疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[1]。②aGVHD的診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)符合西雅圖Fred Hutchinson腫瘤分級(jí)法[2]。③移植后早期病毒感染：allo-HSCT后100天內(nèi)，通過(guò)檢測(cè)患者外周血EBV-DNA、CMV-DNA、JCV-DNA、BKV-DNA等拷貝數(shù)大于1×10^3認(rèn)為存在病毒感染。
　　

7、3.標(biāo)本采集：患者移植前及移植后滿1、2、3、4.5、6、9、12個(gè)月采取外周血4ml，EDTA抗凝；對(duì)照組在干細(xì)胞動(dòng)員前采血。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM；美國(guó)BD公司FACSCantoll流式細(xì)胞儀）檢測(cè)各亞群免疫細(xì)胞數(shù)量變化?？贵w組合：自然殺傷（NK）細(xì)胞：CD16+CD56；B細(xì)胞：CD19；T細(xì)胞：CD3、CD3+CD4、CD3+CD8。
　　5.供受者KIR基因分型及KIR遺傳型檢測(cè)

8、采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）法。由上海荻碩貝肯醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所協(xié)助檢測(cè)。檢測(cè)內(nèi)容包括16種KIR分子類型及其基因型。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料的組間比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1.NK細(xì)胞恢復(fù)情況：移植后CD16+CD56+NK細(xì)胞在移植后1個(gè)月時(shí)即恢復(fù)正常水平（448.29±343.36/ul vs329.32±174.

9、58/ul，P=0.119）。此后不同時(shí)間點(diǎn)均與正常無(wú)差異。
　　2.NK細(xì)胞恢復(fù)與aGVHD：移植后滿1、2、3個(gè)月監(jiān)測(cè)點(diǎn)，CD16+CD56+細(xì)胞在aGVHD發(fā)生組較未發(fā)生aGVHD組明顯降低(1m222.60±148.45/ul vs581.06±358.64/ul；2m199.70±139.48/ul vs474.76±267.28/ul；3m143.88±80.59/ul vs333.50±180.32/ul)；P值分別

10、為0.010、0.002、0.003。提示NK細(xì)胞減低與aGVHD發(fā)生相關(guān)。
　　3.NK細(xì)胞恢復(fù)與疾病復(fù)發(fā)：38例患者中，6例患者移植后復(fù)發(fā)，其中4位患者NK細(xì)胞檢測(cè)至移植后3個(gè)月。CD16+CD56+細(xì)胞在復(fù)發(fā)組較未復(fù)發(fā)組明顯降低(1m205.00±182.18/ul vs555.90±337.03/ul；2m244.00±89.61/ul vs402.18±281.19/ul；3m165.00±61.37/ul vs281.

11、11±181.86/ul)；P值分別為0.040、0.039、0.043。提示NK細(xì)胞減低與移植后復(fù)發(fā)相關(guān)。
　　4.NK細(xì)胞恢復(fù)與移植后早期病毒感染：12/38例患者發(fā)生早期病毒感染，病毒感染組患者移植后1-3個(gè)月時(shí)NK細(xì)胞數(shù)明顯低于無(wú)病毒感染組患者(1m269.42±257.35/ul vs644.73±309.92/ul；2m189.83±130.74/ul vs519.33±251.10/ul；3m143.40±83.42

12、 vs365.50±170.84/ul)，P值分別為0.002，0.000，0.001，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析顯示NK細(xì)胞減低與移植后早期病毒感染相關(guān)。
　　5.28對(duì)供受者的KIR基因分型與aGVHD發(fā)生，①供受者KIR基因型完全相同的占64.3％(18/28例)；②受者KIR基因型包含供者的占17.9%（5/28例）；③供者KIR基因型包含受者的占14.3%（4/28例）；④供受者雙方均含有對(duì)方?jīng)]有的KIR基因型的占3.5%（1

13、/28例）；移植物抗宿主方向的（graft-versus-host direction，GVH方向）KIR基因相合率為82.1%（23/28例），KIR不相合率為17.9%（5/28例）。其中KIR基因型相合組aGVHD的發(fā)生率為60.9%（14/23例），KIR基因型不相合組aGVHD的發(fā)生率為0%，(P=0.020)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而供受者KIR基因相合組OS率為69.6%（16/23例），不合組OS率為80.0%（4/5例），

14、（P=0.552），兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示KIR基因不合患者aGVHD發(fā)生率減低。
　　6.aGVHD發(fā)生與KIR遺傳型28例患者中，其供者KIR遺傳型為A/A型組和B/X型供者組aGVHD的發(fā)生率分別為65%（13/20例）和12.5%（1/8例）；OS率分別為65%（13/20例）和87.5%（7/8例）；（P值分別為0.016和0.240）。提示B/X型供者aGVHD的發(fā)生率低于A/A型。
　　7.供者活化型KI

15、R-2DS1基因陽(yáng)性時(shí)，aGVHD發(fā)生率為14.28%（1/7例），KIR-2DS1為陰性時(shí)，aGVHD發(fā)生率為61.9%（13/21例），二者比較P=0.038，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但兩組間OS率71.4%(6/7)vs66.6%(14/21)無(wú)差異(P=0.327)。提示KIR-2DS1陽(yáng)性供者aGVHD發(fā)生率低于KIR-2DS1陰性。
　　結(jié)論:
　　1.allo-HSCT后CD16+CD56+NK細(xì)胞恢復(fù)迅速，1個(gè)月可