aGVHD在allo-HSCT后小鼠彌漫性肺損傷的作用及機(jī)理研究.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是當(dāng)今治療惡性和難治性造血系統(tǒng)疾病的重要手段，影響allo-HSCT后療效的最主要原因仍是移植物抗宿主病(GVHD)和肺部并發(fā)癥。allo-HSCT后約50％患者出現(xiàn)肺部并發(fā)癥，其中近一半患者因肺部并發(fā)癥而致死。移植后肺損傷按病因分為感染與非感染性肺損傷，按出現(xiàn)時(shí)間早晚分為早期(移植后100天內(nèi))和晚期(移植后100天后)肺損傷。既往約半數(shù)以上患者的肺損傷是因感染所致，但近些年因廣譜抗感染藥物的

2、預(yù)防應(yīng)用，感染因素所致的肺損傷比例下降，而非感染因素成為肺損傷的最主要原因。多數(shù)研究認(rèn)為allo-HSCT后晚期非感染性彌漫性肺損傷由免疫異常所致，與慢性GVHD(cGVHD)有關(guān)，早期非感染性彌漫性肺損傷是否與急性GVHD(aGVHD)有關(guān)尚存在爭(zhēng)論。 目的： 通過建立小鼠allo-HSCTaGVHD模型，研究小鼠aGVHD中肺臟損傷及其損傷機(jī)理。 方法： 1.采用MHC完全不相合的純種近交系小鼠：供鼠

3、為雄性C57BL/6(H-2b)鼠；受鼠為雌性BALB/c(H-2d)鼠，建立allo-HSCT中aGVHD動(dòng)物模型。 2.移植預(yù)處理方案采用全身照射(TBI)8.0Gy，劑量率為0.5Gy/min。小鼠隨機(jī)分為三組：?jiǎn)渭冋丈?A組)、同基因骨髓移植(B組)、異基因骨髓移植(C組)，每組各36只(其中12只用作aGVHD模型的建立，24只用作aGVHD中肺損傷研究)。 3.三組小鼠的肺臟移植后第3d、第7d、單純照射組第

4、12d(瀕死前)、同基因移植組第12d和第14d、異基因移植組第14d(發(fā)生aGVHD后3d)分別進(jìn)行CT、病理組織切片，蛋白液相芯片技術(shù)檢測(cè)移植受鼠肺臟細(xì)胞因子TNFα、IFNγ的變化。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0軟件包處理，小鼠存活時(shí)間采用KIndependentSamplesTest分析，利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線；小鼠造血重建時(shí)間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；第3d、第7d細(xì)胞因子采用One-wayANOVA

5、檢驗(yàn)，第17d細(xì)胞因子采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P≤0.05表示差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1.小鼠aGVHD模型建立： ①造血重建：本研究動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果表明：預(yù)處理3d后三組小鼠WBC<1×109/L，且單純照射組WBC始終<1×109/L，同基因移植組和異基因移植組WBC>1.0×109/L的時(shí)間分別為9.33±2.31d、10.33±1.65d(P值為0.501)，兩組造血重建時(shí)間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ②G

6、VHD的觀察：三組小鼠照射后前6d變化類似：體重進(jìn)行性下降，伴活動(dòng)減少，嗜睡，皺毛，弓背但無腹瀉。單純照射組小鼠第6d開始死亡，死亡高峰在移植后9d～12d，第12d全部死亡；同基因移植組小鼠第7d起體重逐漸增加，至移植后3w時(shí)體重恢復(fù)正常并繼續(xù)增加，該組小鼠未出現(xiàn)aGVHD的癥狀，全部存活時(shí)間大于60d；C組小鼠第7d～10d體重略回升，11d后體重再度開始下降，并11d左右再次出現(xiàn)活動(dòng)減少，嗜睡，弓背，脫毛，腹瀉典型GVHD表現(xiàn)，死

7、亡高峰在移植后第15～17d，第17d全部死亡，單純照射組、同基因移植組小鼠未發(fā)生aGVHD，異基因移植組小鼠全部出現(xiàn)aGVHD表現(xiàn)，發(fā)生率100％。 ③受鼠生存期觀察：A、B、C三組小鼠平均存活時(shí)間分別為9.67±2.25d；全部存活>60d：15.17±1.33d，三組間差異有顯著性意義(P=0.000)。 2.小鼠肺部影像學(xué)變化：第3d、第7d三組小鼠肺臟未出現(xiàn)影像學(xué)變化，單純照射組小鼠移植后第12d(瀕死前)6只

8、有1只出現(xiàn)雙肺毛玻璃狀滲出影，同基因移植組第12d和第14d未出現(xiàn)影像學(xué)變化，異基因移植組小鼠第14d(發(fā)生aGVHD后3d)6只有4只出現(xiàn)雙肺毛玻璃狀滲出影。 3.肺組織病理學(xué)結(jié)果：三組小鼠第3d病變類似：肺臟上皮細(xì)胞輕度水腫、肺泡壁水腫、散在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，屬于輕度間質(zhì)性肺炎；單純照射組第7d肺組織病變：肺臟上皮細(xì)胞水腫、增生，肺間隔增寬；第12d(瀕死前)肺組織病變：肺泡上皮細(xì)胞增生，肺泡腔出血、蛋白物滲出，肺部局

9、部實(shí)變；同基因移植組小鼠第7d肺組織表現(xiàn)：肺臟上皮細(xì)胞輕度水腫，較第3d病變減輕；第14d肺組織恢復(fù)正常。異基因移植組小鼠第7d肺組織病變：肺臟出現(xiàn)毛細(xì)血管高度擴(kuò)張、充血，肺間隔增寬、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；第14d(發(fā)生aGVHD后3d)肺組織病變：肺臟出現(xiàn)肺水腫、上皮細(xì)胞增生，肺泡腔淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，蛋白物滲出，肺間隔明顯增寬、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)小動(dòng)脈炎、小靜脈周圍炎癥，屬于局造性中度間質(zhì)性肺炎。 4.利用蛋白液相芯片技術(shù)對(duì)三組

10、小鼠第3d、第7d、第17d檢測(cè)肺臟細(xì)胞因子：細(xì)胞因子TNFα在第3d時(shí)三組分別為48.167±7.679(pg/ml)、48.667±9.223(pg/ml)、46.167±4.792(pg/ml)，三組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.830)；第7d時(shí)三組分別為34.000±2.608(pg/ml)、45.500±6.899(pg/ml)、62.500±6.253(pg/ml)，三組比較組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，異基因

11、移植組明顯高于單純照射組和同基因移植組；第17d時(shí)同基因移植組和異基因移植組分別為51.167±4.262(pg/ml)、63.667±12.242(pg/ml)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)，異基因移植組高于同基因移植組。細(xì)胞因子IFNγ在第3d時(shí)三組分別為319.833±12.481(pg/ml)、364.000±66.798(pg/ml)、382.000±29.435(pg/ml)，第7d時(shí)三組分別為397.500±3

12、7.914(pg/ml)、380.500±33.243、399.833±29.968(pg/ml)；第3d和第7d三組IFNγ比較組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.062、0.571)。IFNγ在第17d時(shí)同基因移植組和異基因移植組分別為405.167±23.928(pg/ml)、309.333±52.099(pg/ml)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，異基因移植組低于同基因移植組。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)