1-甲脲乙醇酸酐、甲基胍對(duì)HK-2細(xì)胞的凋亡、纖維化相關(guān)因子表達(dá)及藥物干預(yù)的研究.pdf

1、第一部分1．甲脲乙醇酸酐對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、纖維化相關(guān)因子表達(dá)及其干預(yù)因素的體外研究 目的：研究1．甲脲乙醇酸酐對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡及纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響，以及PGEl和普羅布考的干預(yù)作用。 方法： 1．培養(yǎng)HK-2細(xì)胞； 2．不同濃度1-甲脲乙醇酸酐分組與HK-2細(xì)胞共同培養(yǎng)，用MTT比色試驗(yàn)法、檢測(cè)NAG酶釋放、Hoechst染色及Annexin V-FITC／PI流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡，來(lái)觀察

2、其對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性作用；通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR檢測(cè)TGF-β1、CTGF和FN，并進(jìn)一用流式細(xì)胞儀對(duì)以上因子作定量檢測(cè)，以觀察其對(duì)HK-2細(xì)胞的促纖維化作用；并分別加入PGEl和普羅布考了解以上藥物對(duì)HK-2細(xì)胞的保護(hù)作用。 結(jié)果： 1．HK-2細(xì)胞加入肌酐、1-甲脲乙醇酸酐后，較正常對(duì)照組吸光度值顯著下降(P<0.01)，NAG酶濃度顯著上升(P<0.01)；0.5mMol／L1-甲脲乙醇酸酐加入PGEl、

3、普羅布考后，吸光度值顯著上升，NAG酶濃度顯著下降，PGEl改變幅度大于后者，有顯著性差異(P<0.01)。1-甲脲乙醇酸酐0.25mMol／L、O.5mMol／L和1mMol／L三個(gè)不同濃度組間有顯著性差異(P<0.01)，隨濃度下降，吸光度值上升，NAG酶濃度顯著下降。1-甲脲乙醇酸酐與同摩爾濃度肌酐比較，吸光度值顯著下降(P<0.01)，NAG酶濃度顯著下降。 2．HK-2細(xì)胞加入1-甲脲乙醇酸酐后，Hoechst3325

4、8染色顯示呈藍(lán)色的細(xì)胞核，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮，染色加深，并出現(xiàn)凋亡小體。 3．流式細(xì)胞術(shù)顯示甲脲乙醇酸酐組HK-2細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組、肌酐組(P<0.01)。在甲脲乙醇酸酐中分別加入PGEl、普羅布考后，凋亡率顯著下降(P<0.01)，但PGEl下降幅度大于后者，兩者有顯著性差異(P<0.05)。肌酐組與對(duì)照組比較(P>0.05)，無(wú)顯著性差異，但前者凋亡率大于后者。 4．在1-甲脲乙醇酸酐刺激后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色

5、，顯示TGF-β1、CTGF和FN均有強(qiáng)表達(dá)；流式細(xì)胞儀定量、RT-PCR顯示三者甲脲乙醇酸酐組顯著高于正常對(duì)照組和肌酐組(P<0.01)，加入PGEl、普羅布考后，表達(dá)顯著下降(P<0.01)，下降幅度PGEl顯著高于后者(P<0.01)。 結(jié)論： 1．肌酐降解為1-甲脲乙醇酸酐后，促腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死作用顯著增強(qiáng)。 2．1-甲脲乙醇酸酐能顯著促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、CTGF和FN表達(dá)，提示有促腎

6、小管上皮細(xì)胞纖維化作用。 3．PGEl、普羅布考對(duì)1-甲脲乙醇酸酐損害腎小管上皮細(xì)胞有一定的阻止作用。 第二部分 甲基胍對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、纖維化相關(guān)因子表達(dá)及其干預(yù)因素的體外研究 目的:研究甲基胍對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡及纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響,以及PGEl和普羅布考的干預(yù)作用 方法: 1.培養(yǎng)HK-2細(xì)胞 2.不同濃度甲基胍分組與HK-2細(xì)胞共同培養(yǎng),用MTT比色試驗(yàn)法、檢測(cè)N

7、AG酶釋放、Hoechst染色及Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡,來(lái)觀察其對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性作用;通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR檢測(cè)FGF-β1、CTGF和Fn,并進(jìn)一用流式細(xì)胞儀對(duì)以上因子作定量檢測(cè),以觀察其對(duì)HK-2細(xì)胞的纖維化相關(guān)因子表達(dá);并分別加入PGEl和普羅布考了解以上藥物對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡及纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1.HK-2細(xì)胞加入肌酐、甲基胍后,較正常對(duì)照組吸光度值顯著

8、下降(P<0.01),NAG酶濃度顯著上升(P<0.01);0.5mMol/L甲基胍加入PGEl、普羅布考后,吸光度值顯著上升,NAG酶濃度顯著下降,PGEl改變幅度大于后者,有顯著性差異(P<0.01)。甲基胍0.25mMol/L、0.5mMol/L和1mMol/L不同濃度組間有顯著性差異(P<0.01),隨濃度下降,吸光度值上升,NAG酶濃度顯著下降。甲基胍與同摩爾濃度肌酐比較,吸光度值顯著下降(P<0.01),NAG酶濃度顯著下降

9、。 2．HK-2細(xì)胞加入甲基胍后，Hoechst33258染色顯示凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮，染色加深，并出現(xiàn)凋亡小體。 3．流式細(xì)胞術(shù)顯示甲基胍組HK-2細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組、肌酐組(P<0.01)。在甲基胍中分別加PGEl、普羅布考后，凋亡率顯著下降(P<0.01)，PGEl但下降幅度大于后者，兩者有顯著性差異(P<0.05)。 4．在甲基胍刺激后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色，顯示TGF-βl、CTGF和Fn均有強(qiáng)表達(dá)；流

10、式細(xì)胞儀定量、RT-PCR顯示三者甲基胍組顯著高于正常對(duì)照組和肌酐組(P<0.01)，加入XPGEl、普羅布考后，表達(dá)顯著下降(P<0.01)，下降幅度PGEl顯著高于后者(P<0.01)。 結(jié)論： 1．甲基胍有促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用，且較其前身物質(zhì)肌酐更強(qiáng)。 2．甲基胍有促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞纖維化相關(guān)因子表達(dá)的作用。 3．PGEl、普羅布考對(duì)甲基胍所致腎小管上皮細(xì)胞凋亡及纖維化相關(guān)因子的表達(dá)有一定的