高壓氧對(duì)小鼠缺血再灌注腎組織血管生成、凋亡相關(guān)因子和纖維化因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　通過建立同系（C57BL/6J）小鼠腎缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)模型觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κ B）、低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible fa

2、ctor-lalpha，HIF-1α）和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor,CTGF）在缺血再灌注腎組織中的表達(dá)變化以及高壓氧(hyperbaric oxygenation，HBO)治療對(duì)這些因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究缺血再灌注后腎組織的病理生理改變以及HBO對(duì)缺血再灌注腎損傷的治療作用和機(jī)制。
　　方法：
　　將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、腎缺血組、HBO

3、+腎缺血組、腎IR組、腎IR﹢HBO治療組，然后再分別將IR組及IR﹢HBO治療組分為1h、3h、6h、12h、24h組，每小組6只小鼠。正常對(duì)照組及切開小鼠腹腔立即處死小鼠取雙腎，假手術(shù)組僅切開腹腔后便將腹腔關(guān)閉；腎缺血組：切開腹腔，雙側(cè)腎蒂阻斷45min后，立即處死小鼠，采血并切取腎臟標(biāo)本；缺血+HBO組：在進(jìn)行腎缺血組相同處理前對(duì)小鼠進(jìn)行1h高壓氧治療；腎IR組：切開腹腔，雙側(cè)腎蒂阻斷45min后開放血流，分別于再灌注后1、3、6

4、、12、24h切取雙腎并采取靜脈血；IR﹢HBO治療組：切開腹腔，雙側(cè)腎蒂阻斷45min后開放血流，分別于再灌注后0、2、5、11、23h時(shí)行HBO治療，治療1h后切取雙腎并采取靜脈血，雙側(cè)腎蒂不阻斷，于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)切取雙腎并采取靜脈血。采用HE染色觀察腎組織的病理改變，免疫組織化學(xué)法檢測(cè) VEGF、BCL-2、NF-κ B和 HIF-1α在腎組織中的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）檢測(cè)VEGF、CTGF的表達(dá)以及全自

5、動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐(SCr)。
　　結(jié)果：
　　1.腎功能變化：結(jié)果顯示，假手術(shù)組與正常對(duì)照組血肌酐無明顯差異，腎缺血組和HBO+腎缺血組的血肌酐值明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），在HBO治療后，腎缺血引起的腎功能損害有改善但不明顯。再灌注后腎功能損害加重，且隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加重，在再灌注24h時(shí)損傷最重。HBO治療則明顯改善了再灌注后的腎功能，以1h、3h、6h和12h時(shí)突出，24小時(shí)后高壓氧治療對(duì)腎功能的

6、保護(hù)作用減弱。
　　2.腎組織病理變化：正常對(duì)照組和假手術(shù)組可見腎小管細(xì)胞無明顯病理改變，缺血組及缺血+HBO組可見腎小管細(xì)胞明顯腫脹，HBO治療后腎小管細(xì)胞腫脹程度較前有輕微好轉(zhuǎn)，IR組于1h時(shí)，可見系膜細(xì)胞輕度增生，腎間質(zhì)血管輕度擴(kuò)張充血，腎小球體積輕度增大，腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹；于3h時(shí)，可見腎小管上皮細(xì)胞腫脹進(jìn)一步加重，呈顆粒樣變性，組織血管充血；于6h時(shí)，可見腎腎小管細(xì)胞已經(jīng)逐漸失去細(xì)胞原有形態(tài)，腎小管上皮細(xì)胞腫脹進(jìn)一

7、步加重，伴少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，12h及24h可見大量的小管細(xì)胞破壞，腎小管細(xì)胞出現(xiàn)了相互融合，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被完全破壞，并出現(xiàn)少量核碎裂核溶解，并出現(xiàn)大量的的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)過高壓氧治療后各時(shí)間點(diǎn)均可見腎小管細(xì)胞腫脹明顯減輕，細(xì)胞破壞明顯減少，核溶解現(xiàn)象也有所減少。
　　3.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VEGF、BCL-2、NF-κ B和HIF-1α在腎組織中的表達(dá)：
　?。?）腎組織VEGF蛋白的表達(dá)變化：VEGF蛋白主要表達(dá)于腎小管上

8、皮細(xì)胞胞質(zhì)，細(xì)胞核少量表達(dá)，高壓氧治療后胞核及胞質(zhì)表達(dá)均增加。相對(duì)定量結(jié)果顯示，腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IR組及腎IR+HBO組VEGF蛋白的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.05），而在腎缺血前運(yùn)用高壓氧治療可見VEGF表達(dá)增加（P＜0.05）。腎IR后，VEGF的表達(dá)較假手術(shù)組呈持續(xù)性上升并在6h達(dá)到峰值（P＜0.05），12h后開始表現(xiàn)出下降趨勢(shì)但仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）；經(jīng)高壓氧治療后，腎IR+HBO組 V

9、EGF對(duì)應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相較于腎IR組有明顯的增加并且在6h增加最為明顯（P＜0.05）。
　?。?）腎組織HIF-1α蛋白的表達(dá)變化：HIF-1α蛋白主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞的胞質(zhì)，細(xì)胞核有少量表達(dá)。相對(duì)定量結(jié)果顯示，腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IR組及腎IR+HBO組HIF-1α蛋白的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.05），而在腎缺血前運(yùn)用高壓氧治療可見HIF-1α表達(dá)增加，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腎缺血再

10、灌注損傷發(fā)生后，HIF-1α的表達(dá)呈持續(xù)性上升并在6h達(dá)到峰值（P＜0.05），12h后開始表現(xiàn)出下降趨勢(shì)但仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）；經(jīng)高壓氧治療后，HIF-1α的表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)相比較于腎IR組有明顯的增加并且在6h增加最為明顯（P＜0.05）。
　　（3）腎組織Bcl-2蛋白的表達(dá)變化：Bcl-2蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)，細(xì)胞核少量表達(dá)。相對(duì)定量結(jié)果顯示，腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IR組及腎IR+HBO組Bcl-

11、2蛋白的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.05），而在腎缺血前運(yùn)用高壓氧治療可見Bcl-2表達(dá)增加，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，Bcl-2的表達(dá)呈持續(xù)性上升并在3-6h達(dá)到峰值（P＜0.05），12h后開始表現(xiàn)出下降趨勢(shì)但仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）；經(jīng)高壓氧治療后，Bcl-2蛋白各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相比較于腎IR組均有明顯的增加并且在3-6h增加最為明顯（P＜0.05）。
　?。?）腎組織NF

12、-κ B蛋白的表達(dá)變化：NF-κ B蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)，細(xì)胞核少量表達(dá)。相對(duì)定量結(jié)果顯示，腎缺血組、HBO+腎缺血組、腎IR組及腎IR+HBO組NF-κ B蛋白的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.05），而在腎缺血后運(yùn)用高壓氧治療預(yù)處理可見NF-κ B表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，NF-κ B的表達(dá)呈持續(xù)性上升并在6h達(dá)到峰值，12h后開始表現(xiàn)出下降趨勢(shì)但仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）；

13、經(jīng)高壓氧治療后，NF-κ B各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)相比較于腎IR組有明顯的減少并且在6h減少最為明顯（P＜0.05）。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）檢測(cè)腎組織VEGF mRNA、CTGF mRNA的表達(dá)變化：
　?。?）腎組織VEGF mRNA的表達(dá)變化：腎缺血組、HBO+腎缺血組，腎IR組及腎IR+HBO組VEGF mRNA的表達(dá)量較正常對(duì)照組和假手術(shù)組均增加（P<0.05），經(jīng)高壓氧治療后HBO+腎缺

14、血組VEGF mRNA的表達(dá)高于腎缺血組（P＜0.05）。腎IR時(shí)VEGF mRNA的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加并在6h達(dá)到峰值（P＜0.05），12h后表達(dá)開始逐漸下降。當(dāng)經(jīng)過高壓氧治療后我們可以發(fā)現(xiàn)腎IR+HBO治療組各時(shí)間點(diǎn)VEGF mRNA的表達(dá)相比較于腎IR組在1h、3h、6h、12h均有明顯增加（P＜0.05），24h無明顯差異（P＞0.05）。
　　（2）腎組織CTGF mRNA的表達(dá)變化：腎缺血組、HBO+腎缺血組

15、、腎IR組及腎IR+HBO組CTGF mRNA的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.05），而在腎缺血后運(yùn)用高壓氧治療預(yù)處理可見CTGF mRNA表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，CTGF mRNA的表達(dá)呈持續(xù)性上調(diào)（P＜0.05）；經(jīng)高壓氧治療后，6h后各時(shí)間點(diǎn)相比較于腎IR組CTGF mRNA的表達(dá)有明顯的減少（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.HBO治療可以通過HIF-VEGF-Not

16、ch通路顯著改善缺血再灌注腎組織的缺氧狀態(tài)，促進(jìn)新生血管的生成，從而減輕腎缺血再灌注損傷。
　　2.HBO治療可以減少CTGF表達(dá)，通過減少致纖維化因子的表達(dá)在對(duì)于腎缺血再灌注損傷中減輕腎臟損傷，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。
　　3.HBO治療可以通過增加Bcl-2的表達(dá)并減少NF-κ B的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞凋亡上游因子的調(diào)控，從而對(duì)腎臟在缺血再灌注損傷中起到了保護(hù)作用。
　　4.HBO治療在腎缺血再灌注早期便開始發(fā)揮保護(hù)作用，對(duì)于