基于HK-2細胞評價藥物腎毒性體外方法的建立.pdf

1、目的:本研究擬采用人腎小管上皮細胞系(HK-2),觀察藥物對HK-2細胞的毒效應,并檢測藥物對其相應毒性指標及腎損傷指標的影響,確立特異性評價藥物腎毒性的體外檢測指標,建立一種基于HK-2細胞評價藥物腎毒性的體外方法,應用于藥物腎毒性的早期預測,為新藥研發(fā)早期腎毒性評價與篩選提供技術方法。
　　方法:
　　1.用單溶液細胞增殖檢測試劑盒(MTS法)測定HK-2及人正常肝細胞(Human liver cell line,L-0

2、2)在不同接種密度條件下的標準曲線,選擇適當吸光度值的接種密度,進一步建立細胞培養(yǎng)6d的生長曲線,確定試驗中每孔的接種細胞數和培養(yǎng)時間。
　　2.在確定了HK-2及L-02細胞接種密度及培養(yǎng)時間的基礎上,進一步以腎毒性藥物慶大霉素、順鉑以及環(huán)孢素A為陽性工具藥,同時以沒有腎毒性的肝毒性藥物硫唑嘌呤為陰性參照,MTS法測定四種藥物分別對HK-2及L-02細胞活率的影響,并以細胞活率數據為基礎,根據不同濃度藥物導致細胞活率變化的曲線采

3、用IC50計算軟件線性回歸進行擬合求出細胞在體外培養(yǎng)模型中出現10％活率抑制的藥物濃度,將IC10作為我們對比藥物器官選擇性的依據,驗證HK-2細胞用于藥物腎毒性體外研究的可行性。
　　3.以慶大霉素、順鉑、環(huán)孢素A及硫唑嘌呤作用于體外培養(yǎng)的HK-2及L-02細胞株,考察四種藥物對HK-2細胞的毒性效應:倒置相差顯微鏡觀察給藥24h后HK-2細胞形態(tài),MTS法檢測藥物對HK-2細胞的存活情況,AO/EB熒光染色法觀察藥物對HK-2

4、細胞的凋亡情況;采用自動生化分析儀檢測HK-2及L-02細胞培養(yǎng)上清中相應毒性指標LDH、ALT、AST、ALP、γ-GT的變化,通過對比兩種細胞中肝腎毒性藥物反映細胞毒性的檢測指標來尋找特異反映藥物腎毒性的指標。
　　4.N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是一種位于溶酶體內的酸性水解酶,主要分布于皮質近曲小管細胞內。當近曲腎小管受到損傷時,尿中NAG的活性顯著增高,且較其他酶的增高更早出現,測定NAG對腎小管損害的早期診斷有

5、較大的價值。腎損傷分子-1(KIM-1)作為一種腎小管損傷的生物標志物,是一種1型跨細胞膜蛋白,在正常組織中表達非常低,但在腎損傷時會在去分化的腎近曲小管上皮細胞中高度表達。本研究在已完成的KIM-1可早期預測藥物造成腎損傷體內試驗的基礎上,進一步驗證其體外分泌情況是否與體內試驗一致,驗證其是否可以作為體外評價藥物腎毒性的檢測指標。以人腎小管上皮細胞(HK-2)作為研究對象,采用體內試驗中所用的慶大霉素、順鉑、環(huán)孢素A作為受試藥物,同時

6、加入一種沒有腎毒性的肝毒性藥物硫唑嘌呤作為陰性參照,底物顯色法檢測細胞培養(yǎng)上清中N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的釋放,ELISA法檢測培養(yǎng)上清中腎損傷分子-1(KIM-1)的分泌,重點比較腎損傷標志物NAG、KIM-1與動物體內試驗結果、細胞毒性指標的差異,對其體內外相關性及其作為體外腎毒性指標的特異性和敏感性進行確證性研究。
　　結果:
　　1.根據HK-2及L-02細胞的標準曲線計算出相應的細胞數,繪制兩種細胞培

7、養(yǎng)6d的生長曲線,選擇進入對數生長期、生長迅速的接種密度,以保證細胞生長達最佳狀態(tài),減少由于細胞自身狀態(tài)的差異所造成的誤差。兩種細胞均選擇了5000cells/孔的接種密度和24h的培養(yǎng)時間。
　　2.通過比較四種藥物的IC10值發(fā)現,3種腎毒性藥物慶大霉素、順鉑以及環(huán)孢素A的IC10HK-2值均小于IC10L-02,而硫唑嘌呤作為肝毒性藥物其IC10HK-2值則大于IC10L-02,說明:HK-2細胞對腎毒性藥物比較敏感,結合L

8、-02細胞能夠很好地反映藥物在各器官毒性的差異性,能夠在體外正確地反映藥物腎毒性的大小,將該細胞模型應用于藥物腎毒性的體外評價與篩選是可行的。
　　3.從細胞的形態(tài)、存活、凋亡等三個方面考察了藥物對HK-2細胞的毒效應,并通過對比四種藥物所致HK-2及L-02細胞上清中相應毒性指標的變化,確定了LDH及AST可作為反映細胞毒性的非特異性指標、γ-GT可作為特異反映藥物腎毒性的指標,為藥物的體外腎毒性評價提供檢測依據,進而用于藥物腎

9、毒性的評價與篩選。
　　4.以人腎小管上皮細胞(HK-2)作為研究對象,采用體內試驗中所用的慶大霉素、順鉑、環(huán)孢素A作為受試藥物,同時加入一種沒有腎毒性的肝毒性藥物硫唑嘌呤作為陰性參照,考察了不同梯度濃度藥物對HK-2細胞分泌NAG、KIM-1的量效關系,發(fā)現不同濃度三種腎毒性藥物作用于HK-2細胞24h后,在藥物較低濃度時即可刺激HK-2細胞中NAG、KIM-1分泌水平的升高,與體內試驗中此三種藥物誘導的大鼠損傷模型尿中NAG、

10、KIM-1明顯升高的結果一致,這表明NAG、KIM-1作為體外腎毒性指標與體內結果具有很好的相關性。而肝毒性藥物硫唑嘌呤作為陰性參照,在作用于HK-2細胞24h后未引起HK-2細胞中KIM-1的分泌出現顯著性升高,唯有腎毒性的藥物在體外可以引起HK-2細胞KIM-1的顯著分泌,說明KIM-1在體外的腎損傷評價中具有很好的特異性。而N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是細胞內溶酶體釋放的一種酸性水解酶,在四種藥物作用HK-2細胞24h后

11、其活性均出現了顯著性升高,說明其特異性較KIM-1低,但其仍可作為體外評價藥物腎毒性很好的輔助診斷指標。HK-2細胞上清中KIM-1的分泌一般在細胞損傷較輕、凋亡較少的情況下即出現顯著升高,在細胞損傷較嚴重、存活細胞數少的情況下則分泌增加較少,而細胞上清中LDH、AST、γ-GT、NAG的分泌則隨著藥物處理濃度的升高而增加,一般在細胞明顯損傷、凋亡的情況下才出現顯著性變化。提示:KIM-1與細胞毒性指標及傳統腎損傷指標NAG相比,可以在

12、更低的細胞損傷、凋亡作用下即出現顯著性變化,在腎損傷評價中可能具有更高的敏感性和特異性。
　　結論:初步建立了基于HK-2細胞評價藥物腎毒性的體外方法:首先通過比較藥物對HK-2及L-02細胞的IC10值來考察藥物毒性的器官選擇性,對藥物的腎毒性進行初步評價;其次通過考察藥物對HK-2細胞的存活、凋亡及毒性指標LDH、AST、γ-GT、NAG、KIM-1的變化綜合評價藥物的體外腎毒性,為新藥研發(fā)早期腎毒性評價與篩選提供體外檢測方法