烏司他丁對組蛋白誘導腎小管上皮細胞(HK-2)損傷的保護作用及機制.pdf

1、研究背景:
　　膿毒癥急性腎損傷是危重病人常見的臨床并發(fā)癥之一，可作為一項獨立危險因素影響患者預后，給患者及社會帶來巨大負擔。膿毒癥AKI病理生理學發(fā)病機制復雜，其中越來越多的研究顯示:腎小管上皮細胞凋亡及細胞自噬功能異常在膿毒癥AKI發(fā)病過程中起重要作用。近來，新的研究發(fā)現(xiàn):細胞外組蛋白作為損傷相關(guān)模式分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs），是介導膿毒癥器官功能障礙的重要介質(zhì)

2、，包括膿毒癥AKI。前期工作發(fā)現(xiàn):組蛋白可以線粒體凋亡途徑誘導腎小管上皮細胞凋亡。那么改善組蛋白誘導的腎小管上皮細胞損傷也許是防治膿毒癥AKI的新思路。
　　烏司他丁(Ulinastatin，UTI)是從尿液中分離純化而來的一種廣譜蛋白酶抑制劑，大量臨床研究證實烏司他丁對膿毒癥、急性肺損傷、重癥急性胰腺炎、部分肝切除術(shù)后肝功能、心肺旁路術(shù)后急性腎損傷、術(shù)后認知功能障礙、多器官能障礙綜合征等具有良好療效，而具體機制有待進一步研究。眾

3、多研究顯示烏司他丁具有廣泛的生物學效應，如穩(wěn)定細胞溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制炎癥瀑布樣反應、清除氧自由基、保護線粒體等機制發(fā)揮器官保護作用。那么，烏司他丁對組蛋白誘導的腎小管上皮細胞損傷起保護作用，值得探究。
　　研究目的:
　　1.明確烏司他丁(UTI)是否對組蛋白(CTH)誘導的腎小管上皮細胞損傷起保護作用;
　　2.初步探討烏司他丁(UTI)減少組蛋白(CTH)誘導腎小管上皮細胞損傷的可能作用機制。

4、>　　研究方法:
　　1.用CCK-8法檢測不同濃度組蛋白及一定組蛋白濃度處理不同時間，UTI及CTH對HK-2細胞活性的影響。
　　2.AnnexinⅤFITC/PI雙染流式細胞儀檢測UTI對組蛋白誘導HK-2細胞凋亡的影響。
　　3.Hoechst染色倒置熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)學變化。
　　5.Rhodamine123染色流式細胞儀檢測線粒體膜電位(MMP)變化。
　　6.DCFH-DA染色流式細胞儀

5、檢測活性氧(ROS)的產(chǎn)生。
　　7.Western blot法測定Bcl-2、Cleaved Casepase-3、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達水平.
　　研究結(jié)果:
　　1.CTH能明顯降低HK-2細胞活性，具有濃度、時間依賴性，CTH IC50為64.25ug/ml;不同濃度UTI組(500U/ml、1000U/ml、2000U/ml)對組蛋白誘導的HK-2細胞凋亡率均有保護作用，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義;

6、高濃度UTI(2000U)對HK-2細胞活性無明顯抑制作用;
　　2.AnnexinⅤFITC/PI雙染證實CTH能引起HK-2細胞發(fā)生凋亡，而UTI能減少CTH引起的HK-2細胞凋亡(p＜0.01)。
　　3.Hoechst染色結(jié)果顯示:CTH能引起HK-2細胞發(fā)生凋亡，細胞核固縮濃染，致密濃染點明顯增多;而UTI能減少CTH引起的HK-2細胞凋亡，致密濃染點減少。
　　4.Rhodamine123染色結(jié)果顯示:CT

7、H能引起HK-2細胞線粒體膜電位下降，而UTI能減弱CTH引起的線粒體膜電位下降。
　　5.DCFH-DA染色發(fā)現(xiàn):CTH能引起HK-2細胞活性氧(ROS)產(chǎn)生增多，而UTI能減弱CTH引起的活性氧生成。
　　6.Western blot法測得:CTH能引起HK-2細胞Cleaved Caspase-3、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達上升，Bcl-2蛋白表達下降(p＜0.05);而UTI能下調(diào)CTH引起的LC3Ⅱ、Becl