重組人紅細胞生成素對高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)HK-2細胞RhoA-ROCK信號通路的影響.pdf

1、目的:
　　探討重組人紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)對高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)正常人腎小管上皮細胞(human kidney proximal tubular epithelial cell-2,HK-2細胞) RhoA/ROCK信號通路的影響,為糖尿病腎病( diabetic nephropathy,DN)患者藥物治療尋找新的途徑。
　　方法:
　　將體外培養(yǎng)的

2、HK-2細胞按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、高糖誘導組(D-葡萄糖終濃度30mmol/l)、滲透壓對照組(甘露醇終濃度24.5mmol/l)、rhEPO對照組(rhEPO終濃度為20 U/ml)、不同濃度rhEPO組(rhEPO終濃度分別為5、10、20 U/ml)及Rho激酶抑制劑(Y27632)組(Y27632終濃度為10μmol/l,加入Y2763230 min后加D-葡萄糖,D-葡萄糖終濃度為30 mmol/l),各實驗組均給予誘

3、導時間為24 h。光學顯微鏡下觀察各實驗組HK-2細胞形態(tài)學的變化。RT-PCR法檢測各實驗組HK-2細胞中RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表達水平;細胞免疫熒光法檢測各實驗組HK-2細胞E-鈣黏蛋白(epithelial- cadherin, E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達情況;ELISA法檢測各實驗組HK-2細胞培養(yǎng)上清液中纖維連接蛋白(fibrone

4、ctin,FN)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等蛋白的表達。流式細胞術(shù)檢測各實驗組HK-2細胞凋亡的變化。
　　結(jié)果:
　　光學顯微鏡下觀察HK-2細胞形態(tài)的變化,正常HK-2為橢圓形或梭形,呈“鵝卵石”或“鋪路石”樣排列,給予高糖刺激后細胞胞體逐漸變長,細胞間隙逐漸變大,但給予不同濃度rhEPO或Y27632后,其形態(tài)學明

5、顯改善。RT-PCR結(jié)果顯示高糖誘導組RhoAmRNA及ROCK1mRNA表達較空白對照組顯著升高(P<0.05),但分別給予不同濃度rhEPO干預后,RhoAmRNA及ROCK1mRNA的表達顯著減少(P<0.05)。給予Y27632抑制后,RhoAmRNA的表達較高糖誘導組無顯著性差異(P>0.05),而 ROCK1mRNA的表達則明顯減少(P<0.05)。ELISA及細胞免疫熒光結(jié)果顯示高糖誘導組FN蛋白、α-SMA蛋白的表達較空

6、白對照組明顯增加(P<0.05),但分別加入不同濃度rhEPO干預或Y27632抑制后,FN蛋白、α-SMA蛋白的表達明顯減少(P<0.05)。高糖組 E-cadherin蛋白表達較空白對照組明顯減少,分別給予不同濃度rhEPO干預或Y27632抑制后, E-cadherin蛋白表達明顯增加(P<0.05),在實驗用rhEPO濃度范圍內(nèi),蛋白的表達呈現(xiàn)出與 rhEPO濃度的相關(guān)性。ELISA結(jié)果顯示高糖誘導組 IL-6蛋白、TNF-α蛋

7、白表達較空白對照組明顯增多(P<0.05),但分別給予不同濃度rhEPO干預或Y27632抑制后,IL-6蛋白、TNF-α蛋白表達明顯減少(P<0.05),并且在實驗用rhEPO濃度范圍內(nèi),呈現(xiàn)出rhEPO濃度的依賴性。流式細胞檢測結(jié)果顯示高糖可誘導HK-2凋亡,但給予不同濃度rhEPO干預或Y27632抑制后,HK-2細胞早期凋亡率及晚期凋亡加死亡細胞比率明顯下降(P<0.05)。Person直線相關(guān)分析提示高糖誘導組及不同濃度rhE

8、PO組RhoAmRNA與ROCK1mRNA的表達呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖能通過增加體外培養(yǎng)的 HK-2細胞中 RhoAmRNA、ROCK1mRNA的表達水平,使細胞 E-cadherin蛋白表達減少,α-SMA蛋白表達增多,誘導正常HK-2細胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition,EMT),引起細胞外基質(zhì)成分FN蛋白表達增加,在實驗用rhEPO濃度范圍內(nèi),rh

9、EPO可呈濃度依賴性抑制高糖誘導的 HK-2細胞轉(zhuǎn)分化過程,延緩腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)的進展。
　　2、在實驗用rhEPO濃度范圍內(nèi),rhEPO可呈濃度依賴性地抑制HK-2細胞凋亡從而發(fā)揮其腎臟保護作用。
　　3、rhEPO可以通過減少炎癥因子的產(chǎn)生,減輕炎性反應,從而延緩DN的進展。
　　4、rhEPO對高糖環(huán)境下體外培養(yǎng)的 HK-2細胞的保護作用可能與抑制Rh