維生素D受體激動劑對高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞RhoA活化的影響.pdf

1、目的:通過觀察維生素D受體激動劑活性維生素D(1，25-(OH)-2D3，VitD3）及其類似物埃羅骨化醇(BXL-628)對高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）RhoA活化的影響，研究其對HK-2細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)的作用，并探討其可能機(jī)制。
　　方法:體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，(1)使用高糖培基(30mmol/L)刺激HK-2細(xì)胞。使用Western Blot觀察0 min、30 min、1h、2h、4h、8h

2、、12h活性RhoA蛋白的表達(dá)情況;(2)分別使用Western Blot及RealTime PCR觀察0h、12h、24h、48h、72h時(shí)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和E鈣粘素(E-cadherin)蛋白及mRNA的表達(dá);(3)將HK-2細(xì)胞設(shè)正常對照組（葡萄糖5.6mmol/mL）、高糖（葡萄糖30mmol/mL）組、VitD3組（高糖+VitD3，10-7mol/L）組、BXL-628組（高糖+BXL-628，10-5nmo

3、l/L），使用RealTime PCR、Western Blot方法觀察各組細(xì)胞48hα-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA的表達(dá);采用Elisa酶聯(lián)免疫法及RealTime PCR方法檢測各組細(xì)胞48hⅠ型膠原蛋白(Collagen-Ⅰ，col-Ⅰ)、纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)蛋白及mRNA的表達(dá)。(4)實(shí)驗(yàn)分組同第(3)，分別使用WesternBlot免疫印跡法及免疫熒光技術(shù)檢測各組細(xì)胞2h活性RhoA蛋白

4、的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)高糖刺激下HK-2細(xì)胞活性RhoA蛋白表達(dá)隨時(shí)間逐漸上調(diào)，30min時(shí)表達(dá)較0min即有增加(P＞0.05)，1h時(shí)表達(dá)增加即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，2h達(dá)高峰(P＜0.01)。(2)高糖刺激HK-2細(xì)胞12h以上α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)可增高，12h點(diǎn)較0h比表達(dá)增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，48hα-SMA蛋白及mRNA表達(dá)達(dá)最高(P＜0.01);高糖刺激下，E-cadherin表達(dá)隨時(shí)間逐漸下調(diào)

5、，12h表達(dá)下調(diào)較0h組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，48h下調(diào)最明顯(P＜0.01);(3) VitD3組、BXL-628組α-SMA蛋白及mRNA的表達(dá)較高糖組均明顯下調(diào)(P＜0.01)，且蛋白水平兩組較正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而mRNA水平較正常對照組下調(diào)(P＜0.05);VitD3組及BXL-628組E-cadherin蛋白及mRNA水平均較高糖組明顯上調(diào)(P＜0.05)，蛋白水平兩組較正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

6、＞0.05)，而mRNA水平兩組較正常對照組均有上調(diào)(P＜0.05);ELISA及RealTime PCR結(jié)果顯示，VitD3組及BXL-628組col-Ⅰ、Fn蛋白及mRNA的表達(dá)較高糖組明顯下調(diào)(P＜0.01)。(4)對比正常對照組，高糖組活性RhoA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)，而VitD3組及BXL-628組活性RhoA蛋白的表達(dá)較高糖組明顯下調(diào)(P＜0.01)，且兩組較正常對照組RhoA蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05