新生兒窒息后血清誘導HK-2細胞凋亡的胞內(nèi)信號傳導機制研究.pdf

1、背景：新生兒窒息可以發(fā)生在產(chǎn)前，產(chǎn)時或者產(chǎn)后期。我國現(xiàn)在每年出生約2000萬新生兒，窒息發(fā)生率占活產(chǎn)新生兒的5％-10％，新生兒窒息是當前我國新生兒死亡的第一位死因，也是致殘的重要原因。窒息后多臟器血流動力學變化和各臟器間的血流再分配可導致多器官功能損傷，即缺血再灌注損傷。相關研究表明窒息后的多器官功能損傷中腎損傷的發(fā)生率最高，而腎小管作為腎單位的主要結(jié)構(gòu)之一，其損傷發(fā)生最早，進一步證明損傷最早、最敏感的靶細胞是腎近曲小管上皮細胞。

2、 前期研究發(fā)現(xiàn)，新生兒窒息后腎損傷組外周血白細胞計數(shù)明顯高于非損傷組，且與腎功能損傷程度呈正相關；在窒息大鼠恢復供氧的模型中進一步觀察到腎組織白細胞滯留數(shù)明顯增多。說明一些炎癥細胞因子(IL-8,TNF-α等)及大量氧自由基的產(chǎn)生對窒息的發(fā)病及腎損傷的發(fā)生起重要作用。我們還觀察到用新生兒窒息后血清來處理培養(yǎng)的HK-2細胞其凋亡率增加，證明凋亡是窒息后腎損傷的一種形式。但是，窒息后血清誘導腎小管上皮細胞凋亡的胞內(nèi)信號傳導機制仍不清楚。

3、 線粒體作為真核細胞內(nèi)能量生成的場所，是窒息后細胞損傷最敏感的細胞器。而且在細胞凋亡內(nèi)外多條信號通路中，線粒體通過釋放各種凋亡蛋白形成調(diào)控細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。那么，在窒息后血清誘導腎小管上皮細胞凋亡中是否有線粒體途徑的激活呢? 核因子-kB(NF-kB)作為調(diào)節(jié)細胞基因轉(zhuǎn)錄的關鍵因子之一，是炎癥反應的觸發(fā)器及關鍵環(huán)節(jié)。已證實NF-kB是調(diào)節(jié)編碼多種前炎癥介質(zhì)、細胞因子和粘附分子基因的重要轉(zhuǎn)錄因子。目前研究證實窒息后血清誘

4、導HK-2細胞凋亡的機制牽涉到NF-kB的活化。活化后的核因子-kB是否參與線粒體途徑的激活呢? 因此，本研究在前期實驗的基礎上，探討新生兒窒息后血清對HK-2細胞內(nèi)線粒體膜電位變化，相關凋亡蛋白釋放以及促凋亡蛋白表達的影響及其與NF-kB活化的關系，旨在闡明窒息后腎小管損傷的機制。 目的：研究新生兒窒息后血清誘導人近曲腎小管上皮細胞(HK-2)凋亡的胞內(nèi)信號傳導機制。 方法： (1)以人近曲腎小管上皮細

5、胞(HK-2)為研究對象，用含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。 (2)新生兒窒息后血清的制備：選擇2006年9月～2007年6月在我科住院的未使用免疫抑制劑、無明顯感染性疾病的足月重度室息新生兒。在窒息后24h抽取外周血5mL(肝素抗凝)，離心并分離出血清，滅活補體后-20℃保存?zhèn)溆谩?(3)窒息后血清誘導HK-2細胞損傷模型的建立：采用上述方法處理的窒息后血清，用DMEM/F12培養(yǎng)液配成20％

6、(體積比，v/v)的攻擊濃度，攻擊正常培養(yǎng)的HK-2細胞。 (4)實驗分組：共分為三組，即正常對照組、窒息組和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干預組。PDTC是NF-kB的特異性抑制劑，根據(jù)前期實驗結(jié)果，應用的終濃度為40μM。即在實驗前24h將培養(yǎng)液換成含20％窒息血清的DMEM培養(yǎng)液的同時加入40μM PDTC。 (5)檢測指標：倒置相差顯微鏡下觀察HK-2細胞生長情況；激光共聚焦顯微鏡測HK-2細胞線粒體膜電位(MM

7、P)變化；免疫細胞化學方法檢測HK-2細胞胞漿內(nèi)促凋亡蛋白Bad、Bax的表達情況；Western blot測HK-2細胞內(nèi)線粒體中CytC,AIF的釋放情況。 (6)統(tǒng)計學分析：采用one-way ANOVA分析，組間比較用LSD法。數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS10.0軟件處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： (1)倒置相差顯微鏡下觀察到對照組細胞貼壁生長，呈類上皮樣扁平多角形，折光性強，細胞間連

8、接緊密，分裂像多，數(shù)量多。窒息組細胞生長減慢，貼壁性差，細胞數(shù)量較對照組明顯減少，形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則圓形或橢圓形，折光性減弱，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物，細胞間連接松散，并可見較多細胞碎片。PDTC干預組較對照組細胞數(shù)量變化不大，形態(tài)變化小，部分細胞有收縮變圓，細胞折光性較強。 (2)與正常對照組(2.96±0.38)相比，窒息組(0.87±0.06)和PDTC干預組(2.46±0.52)細胞線粒體膜紅/綠熒光強度比值(590/

9、530nm)明顯降低，差異具有顯著性意義(P<0.01)。但與窒息組相比，PDTC干預組細胞線粒體膜紅/綠熒光強度比值明顯升高，差異有顯著性意義(P<0.01)。 (3)用HSCORE系數(shù)作半定量評分，與正常對照組[(1.97±0.26)和(1.77±0.11)]相比，窒息組[(2.73±0.20)和(2.44±0.13)]和PDTC干預組[(2.38±0.13)和(2.17±0.08)]促凋亡蛋白Bad、Bax的表達均明顯增加

10、，差異具有顯著性意義(P<0.01)；但與窒息組相比，PDTC干預組促凋亡蛋白Bad、Bax的表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 (4)正常組HK-2細胞的胞漿中不含細胞色素C，主要存在于線粒體內(nèi)，條帶光密度值分別為(156.5±3.54，179.5±2.12)；窒息組胞漿中細胞色素C從線粒體漏出較對照組明顯增加，相應的在線粒體內(nèi)表達減少，條帶光密度值分別為(177.5±3.54，155±4.24)，差異有統(tǒng)計學意

11、義(P<0.05)；PDTC干預組胞漿中細胞色素C表達也有所增加，但大部分仍位于線粒體內(nèi)，條帶光密度值分別為(165±4.24，171±5.66)，與窒息組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 (5)正常組HK-2細胞中AIF主要存在于線粒體內(nèi)，條帶光密度值為(212±4.24)；窒息組HK-2細胞中AIF從線粒體中漏出，在線粒體內(nèi)基本檢測不到AIF表達，條帶光密度值為(128±4.24)；PDTC干預組較窒息組線粒體內(nèi)AI