促紅細(xì)胞生成素及黃芪注射液對窒息后血清誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)對新生兒窒息后血清誘導(dǎo)人近曲腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法： (1)以HK-2為研究對象。 (2)以窒息后第一天20％(體積分?jǐn)?shù))血清作為攻擊因素。 (3)第一階段實(shí)驗(yàn)共分為對照組、窒息組和EPO組，EPO組設(shè)立5個(gè)濃度亞組，探討EPO是否具有保護(hù)作用及最適保護(hù)濃度。 (4)第二階段實(shí)驗(yàn)以最適保護(hù)濃度預(yù)處理細(xì)胞

2、，攻擊前分為空白對照組和EPO預(yù)處理組，在攻擊后15min，1h，2h分為相應(yīng)時(shí)間的血清攻擊組和EPO預(yù)處理組后血清攻擊組。 (5)檢測指標(biāo)：第一階段實(shí)驗(yàn)在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，生化法檢測培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(1actatedehydrogenase，LDH)漏出率和MTT法檢測細(xì)胞活力變化；第二階段實(shí)驗(yàn)通過激光共聚焦顯微鏡觀察間接免疫熒光染色NF-κB轉(zhuǎn)位以及免疫印記(Western blot)檢測NF-κB

3、抑制亞基I-κBα量的變化。 (6)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((-x)±S)表示，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行單因素方差分析，組間進(jìn)行LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有顯著性。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。 結(jié)果： (1)倒置相差顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞生長狀況：對照組細(xì)胞貼壁良好，透明度大，折光性強(qiáng)，呈扁平的多角形，分裂相多，細(xì)胞排列緊密，連接成片，數(shù)量多。窒息組細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞數(shù)量比對照組明顯減少，細(xì)胞形

4、態(tài)發(fā)生改變，由典型的扁平多角形細(xì)胞變?yōu)椴灰?guī)則圓形或橢圓形，折光性減弱，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞間空隙加大，連接松散，細(xì)胞間可見較多細(xì)胞碎片。EPO組：隨濃度的增加，細(xì)胞損傷明顯得到改善，當(dāng)濃度≥50IU/ml時(shí)與對照組相似。 (2)與對照組(63.49±1.30％)相比，窒息組LDH漏出率(76.37±1.32％)明顯增加，在EPO組，除EPO 1IU/ml(76.04±1.50％)組外，各濃度EPO與窒

5、息組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。EPO組隨濃度的增加保護(hù)效果逐漸增強(qiáng)，LDH漏出率逐漸減小，EPO 100IU/ml(64.55±1.28％)，50IU/ml(64.40±1.84％)組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 (3)與對照組(0.642±0.018)相比，窒息組細(xì)胞活力(OD值)(0.240±0.036)明顯降低。除EPO 1IU/ml(0.240±0.044)組外，各濃度EPO與窒息組比較，差異均

6、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。EPO組隨濃度的增加保護(hù)效果逐漸增強(qiáng)，EPO 100IU/ml(0.624±0.018)，50IU/ml(0.620±0.016)組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。 (4)攻擊前與空白對照組(9.7±2.1％)相比，EPO預(yù)處理組NF-κB核轉(zhuǎn)位率(20.0±2.6％)顯著增加；而血清攻擊后各組與空白組對照組比較，NF-κB核轉(zhuǎn)位率顯著增加，以攻擊后1小時(shí)最明顯；各時(shí)點(diǎn)EPO預(yù)處理組后血清攻擊

7、組與血清攻擊組相比，NF-κB核轉(zhuǎn)位率顯著減少。 (5)攻擊前與空白對照組(0.52±0.05)相比，EPO預(yù)處理組I-κBa/β-actinIOD比值(0.26±0.03)顯著減少；而血清攻擊后各組與空白組對照組比較，I-κBα/β-actinIOD比值顯著減少，以攻擊后1小時(shí)最明顯；各時(shí)點(diǎn)EPO預(yù)處理組后血清攻擊組與血清攻擊組相比，I-κBα/β-actinIOD比值顯著增加。 結(jié)論：EPO具有減輕窒息后血清所致HK