人白蛋白對(duì)HK-2細(xì)胞FN、TGFβ-,1-、IL-6分泌及凋亡的作用.pdf

1、背景：研究表明尿蛋白是造成腎小管間質(zhì)損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。尿蛋白可直接損傷腎小管上皮細(xì)胞，也可以通過(guò)刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，介導(dǎo)間質(zhì)慢性炎癥及纖維化造成間質(zhì)損害。大量細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的研究表明，蛋白尿的很多成分都能導(dǎo)致這一過(guò)程。白蛋白通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用而被近端腎小管細(xì)胞攝取，此反應(yīng)過(guò)程能誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)及腎小管細(xì)胞凋亡，為了進(jìn)一步探、討白蛋白對(duì)腎小管細(xì)胞的影響，我們利用HK-2細(xì)胞做體外培養(yǎng)，觀察了不同濃度和不同作

2、用時(shí)間人白蛋白對(duì)HK-2細(xì)胞FN、TGFβ<,l>和IL-6分泌水平的影響及凋亡的作用。 目的：探討人白蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞FN、TGFβ<,l>、IL-6分泌水平的影響及凋亡的作用。 方法：本實(shí)驗(yàn)選擇HK-2細(xì)胞株為研究對(duì)象，傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)成片時(shí)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中，人白蛋白分別以0g／L、0.1 g／L、0.5 g/L、2.0 g／L、5.0 g／L、10 g／L和20g／L的濃度作用培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞12小時(shí)及

3、5g／L的人白蛋白分別作用培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞0、6、12、24、48小時(shí)。用ELISA法檢測(cè)HK-2細(xì)胞FN、TGFβ<,1>、IL-6的分泌水平。將培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞與20g／L的人白蛋白共同孵育0、4、6、8小時(shí)后，用Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將培養(yǎng)的HK-2分別與不同濃度(0g／L、5.0 g／L、10 g／L、 20g／L和30g／L)的人白蛋白共同孵育0、4、6、8小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

4、結(jié)果：1.不同濃度人白蛋白作用12小時(shí)對(duì)腿2細(xì)胞FN、rGFβ<,l>和IL-6分泌水平的影響(ELISA法)：結(jié)果顯示： 2.0 g／L、5.0 g／L、10g／L、20 g／L組與對(duì)照組相比較，F(xiàn)N、TGFβ<,l>和IL-6均有顯著性升高(P<0.01)，0.1 g／L、0.5 g／L組。FN、 TGFβ<,l>和IL-6與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FN和TGFβ<,l>在5.0 g／L組分泌水平最高，濃度值分別為

5、(47.55±8.3lng/ml； 124.76±3.10pg/m1)； IL-6在20 g／L組分泌最高，濃度值為(18.04±0.48pg/m1) 2． 5.0 g／L人白蛋白在不同作用時(shí)間對(duì)HK-2細(xì)胞FN、TGFβ<,l>和IL-6分泌水平的影響(ELISA法)：結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比較，作用6h，F(xiàn)N分泌水平升高(P<0.05)，作用12h和24h，F(xiàn)N分泌水平有顯著性升高(P<0.01)，48小時(shí)FN分泌水平開

6、始下降，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TGFβ<,l>分泌水平在6h、12h和24h與對(duì)照組相比較有顯著性升高(P<0.01)，48h與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IL-6分泌水平在6h、12h、24h與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在48h分泌水平下降，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。 3．人白蛋白對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響：20g／L人白蛋白作用于HK-2細(xì)胞12h和48h，通過(guò)倒

7、置顯微鏡觀察，結(jié)果顯示：20g／L人白蛋白處理12小時(shí)后，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞折光性降低，無(wú)明顯脫落漂浮細(xì)胞，但胞漿中顆粒明顯增多。20g／L人白蛋白處理48小時(shí)后，可見大部分細(xì)胞出現(xiàn)脫落漂浮和壞死。 4．人白蛋白對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響 4.1 Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡：結(jié)果顯示：培養(yǎng)基對(duì)照組未見明顯細(xì)胞凋亡；與對(duì)照組相比，HK-2細(xì)胞與20g／L白蛋白共同孵育4、6、8小時(shí)，均可見細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加，典

8、型凋亡形態(tài)的細(xì)胞增多，且隨著人白蛋白與HK-2細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡的程度和數(shù)目增多，提示白蛋白可以致HK-2細(xì)胞凋亡，且與白蛋白濃度和作用時(shí)間有一定的關(guān)系。 4．2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：流式細(xì)胞儀Annexin V聯(lián)合PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：隨著人白蛋白與HK-2細(xì)胞作用的濃度和時(shí)間的增加，與對(duì)照組比較，HK-2細(xì)胞的凋亡率也顯著性增高。細(xì)胞凋亡率在8h組和30g／L組最高，分別為(9.15±0.15％；9.35

9、±0.46％)。HK-2細(xì)胞與30g／L人白蛋白共同孵育8h，用流式細(xì)胞儀DNA細(xì)胞周期分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，30g/L、人白蛋白組出現(xiàn)較對(duì)照組更高的細(xì)胞凋亡蜂，提示30g／L人白蛋白組凋亡較對(duì)照組更明顯。 結(jié)論： 1．不同濃度人白蛋白分別作用HK-2細(xì)胞12小時(shí)，可促進(jìn)．HK-2細(xì)胞分泌FN、FGF-β<,1>和IL-6，人白蛋濃度達(dá)到2.0g／L后， FN、TGF-β<,1>、IL-6的分泌水平

10、顯著增高，F(xiàn)N、TGF-β<,1>在5 g／L時(shí)達(dá)高峰，隨后開始逐漸下降。IL-6在20g／L時(shí)達(dá)高峰，且IL-6的分泌與人白蛋白濃度呈明顯的劑量依賴性。 2.5g／L人白蛋白分別作用HK-2不同時(shí)間，可促進(jìn)HK-2細(xì)胞分泌FN、TGF-β<,1>和．IL-6，作用6小時(shí)，F(xiàn)N、TGF-β<,1>的分泌水平顯著增高， 24小時(shí)達(dá)高峰。IL-6的分泌水平在12小時(shí)達(dá)高峰，隨后逐漸下降，48小時(shí)下降最顯著。 3．人白蛋白以