芍藥苷對(duì)原發(fā)性干燥綜合征患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面P2X7R表達(dá)及炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6分泌的干預(yù)作用.pdf

1、目的:
　　研究芍藥苷(paeoniflorin，PF)對(duì)原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj(o)gren's syndrome，pSS)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)表面嘌呤受體P2X配體門控離子通道7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel7，P2X7R)表達(dá)及ATP誘導(dǎo)的促炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞

2、介素(interleukin，IL)-1β、IL-6分泌的干預(yù)作用，為PF治療pSS提供理論依據(jù)，并為治療此疾病提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.用乳酸脫氫酶釋放法(lactose dehydrogenase release assay，LDH)及酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)確定本實(shí)驗(yàn)中PF的濃度。
　　2.收集20例pSS初發(fā)患者及20例健

3、康志愿者的外周靜脈血，F(xiàn)icoll-Hypaque分離液密度梯度離心提取PBMCs。將提取的PBMCs分成Control組、ATP組、PF+ATP組，37℃/5％CO2條件下體外穩(wěn)定培養(yǎng)24小時(shí)后，Control組不做任何干預(yù)，ATP組用3mM ATP干預(yù)2小時(shí)，PF+ATP組預(yù)先用100μM PF干預(yù)2小時(shí)再加入3mM ATP共同干預(yù)2小時(shí)。
　　3.提取PBMCs的總RNA及總蛋白質(zhì)，分別采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT

4、-qPCR)技術(shù)、蛋白免疫印記技術(shù)(Western-blot assay)技術(shù)檢測P2X7R mRNA和P2X7R蛋白質(zhì)的表達(dá)量。收集PBMCs培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測上清中IL-1β、IL-6的分泌量。
　　4.各組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Student-Newman-Keuls q檢驗(yàn)比較各組P2X7R的表達(dá)和IL-1β、IL-6分泌的差異，以評(píng)估PF對(duì)P2X7R表達(dá)及IL-1、IL-6

5、分泌的干預(yù)作用。
　　結(jié)果:
　　1. PF的濃度為100μM、150μM時(shí)與空白對(duì)照組相比IL-1β分泌量分別為(2819±155.9 vs.3405±81.48)(2383±131.6vs.3405±81.48)(p<0.001)，IL-6分泌量分別為(42880±1664 vs.53110±1563)(47950±1019 vs.53110±1563)(p<0.001)，PF濃度為100μM、150?M可以顯著減少AT

6、P誘導(dǎo)的PBMCs分泌IL-1β、IL-6；而PF濃度150μM組與空白對(duì)照組相比PBMCs LDH釋放量有顯著差異(58.21±4.587 vs.14.17±2.863)(p=0.0012)，150μM PF對(duì)PBMCs有明顯的毒性作用，故本實(shí)驗(yàn)選擇PF濃度為100μM。
　　2. pSS患者PBMCs表面P2X7R mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組(p=0.03，p<0.001)。P2X7R mRNA的表達(dá)量Cont

7、rol組與ATP組、PF+ATP組與ATP組相比分別是(1.096±0.02 vs.4.312±0.08)(p<0.001)、(1.269±0.03 vs.4.312±0.08)(p<0.001)；P2X7R蛋白表達(dá)量Control組與ATP組、PF+ATP組與ATP組相比分別是(0.259±0.01 vs.0.459±0.008)(p<0.001)、(0.216±0.02 vs.0.459±0.008)(p<0.001)。這些結(jié)果表明

8、PF可下調(diào)pSS患者PBMCs表面P2X7R的表達(dá)。
　　3.Control組與ATP組、PF+ATP組與ATP組相比pSS患者PBMCs培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌量分別為((296.3±59.25vs.1191±137.6)(p<0.001)、(256.7±50.68vs.1191±137.6)(p<0.001)，IL-6的分泌量分別為(1009±112.3vs.1480±80.2)(p<0.001)、(962.2±89.06v