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文檔簡介
1、背景和目的:
醛固酮,作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的一個主要成員,負(fù)責(zé)調(diào)控腎臟、結(jié)腸的離子轉(zhuǎn)運(yùn),維持水、電解質(zhì)的平衡.許多研究發(fā)現(xiàn),在嚴(yán)重應(yīng)激病人的體內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)被明顯激活,血清中醛固酮的水平也明顯升高.長久以來,人們認(rèn)為醛固酮可促進(jìn)高血壓和心肌纖維化的發(fā)生,通過促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原的合成,導(dǎo)致心肌重構(gòu)和心肌功能低下.醛固酮可發(fā)揮經(jīng)典的基因組作用,通過與細(xì)胞內(nèi)鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合,進(jìn)而影響靶蛋白
2、的轉(zhuǎn)錄和合成.但是,研究發(fā)現(xiàn),醛固酮也可通過與細(xì)胞膜受體結(jié)合發(fā)揮非基因組作用,主要特點(diǎn)是作用迅速(數(shù)分鐘內(nèi)),不被ALD受體拮抗劑螺內(nèi)酯所抑制[1],也有證據(jù)顯示有些非基因作用方式是由MR介導(dǎo)的,能夠部分被螺內(nèi)酯所抑制.Toll樣受體廣泛存在于天然免疫細(xì)胞膜上,是感知外源性或內(nèi)源性損傷物質(zhì)的“哨兵”.應(yīng)激后,組織受到損傷,細(xì)胞應(yīng)激或者降解導(dǎo)致某些物質(zhì)釋放或者分泌,與Toll樣受體4結(jié)合后介導(dǎo)一系列的炎性反應(yīng).Toll樣受體4可識別一系列
3、的內(nèi)源性識別分子,如高遷移率簇蛋白,透明質(zhì)烷片段,熱休克蛋白,硫酸乙酰肝素和纖維蛋白原等.研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重應(yīng)激后常引起腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)興奮,并伴以不同程度的血管緊張素、醛固酮水平上調(diào)等,它們可能在一定程度上影響免疫功能.本研究探討應(yīng)激后機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)對免疫識別受體-Toll樣受體4信號通路的影響,研究醛固酮調(diào)控THP-1細(xì)胞分泌IL-8的作用與機(jī)制,證實(shí)醛固酮通過Toll樣受體4調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答.
方法:
4、r> 本實(shí)驗(yàn)利用藥物干預(yù)的方法模擬體內(nèi)應(yīng)激狀態(tài)模型,通過酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)動態(tài)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-8的分泌量,確定藥物干預(yù)的最佳劑量和最佳作用時間,并通過實(shí)時熒光定量PCR(polymerase chainreaction)方法觀察在給予拮抗劑治療下,IL-8的mRNA的改變和受體表達(dá)的變化,進(jìn)一步研究醛固酮在應(yīng)激狀態(tài)下調(diào)控IL-8分泌的信號傳導(dǎo)通路及
5、各信號通路之間的相互作用,同時研究醛固酮受體拮抗劑-螺內(nèi)酯和Toll樣受體4單克隆抗體的干預(yù)效果.計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用CHISS2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),組間兩兩比較采用SNK-q(student-newman-keuls,SNK-q)檢驗(yàn),P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.
結(jié)果:
實(shí)時熒光定量PCR和免疫細(xì)胞熒光結(jié)果
6、顯示,人單核巨噬細(xì)胞THP-1有鹽皮質(zhì)激素受體和Toll樣受體表達(dá)。將四個劑量的醛固酮(10nM、102nM、103nM和104aM)與THP-1細(xì)胞共孵育5min、30min、2h、6h和12h,以ELISA方法發(fā)現(xiàn)醛固酮在2h后可明顯上調(diào)THP-1細(xì)胞IL-8的分泌,四個劑量分別為對照組的1.11,2.28,1.63和1.68倍,并隨時間逐漸增高,12h達(dá)到高峰;PCR結(jié)果顯示醛固酮與THP-1細(xì)胞共孵育30min后,THP-1細(xì)胞
7、IL-8 mRNA的表達(dá)為對照組的4.47倍,12h達(dá)到高峰.102nM的醛固酮與THP-1細(xì)胞孵育12h后,應(yīng)用終濃度為10μg/μl的TLR4單克隆抗體和10-6M的螺內(nèi)酯進(jìn)行干預(yù),其對IL-8 mRNA的表達(dá)量均明顯降低(P<0.05).且TLR4單克隆抗體和螺內(nèi)酯同時作用,對阻斷IL-8的分泌和合成具有協(xié)同作用.
結(jié)論:
人單核-巨噬細(xì)胞THP-1存在鹽皮質(zhì)激素受體MR和Toll樣受體4(TLR4).
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