rhGM-CSF對單核細胞THP-1表達CCR2的影響.pdf

1、 靜脈血栓是血管外科臨床常見的一種疾病。靜脈血栓以下肢深靜脈血栓形成多見。目前國內(nèi)外靜脈血栓的治療策略主要是抗凝、祛聚和溶栓等非手術(shù)措施?？鼓挽罹壑委煹哪康脑谟诜乐剐碌难ㄐ纬?，但長期應(yīng)用抗凝和祛聚藥物有導(dǎo)致嚴重出血的風(fēng)險。而溶栓治療雖然能溶解已形成的血栓，但溶栓藥物只能作用于血栓的表面，很難進入血栓內(nèi)部發(fā)揮作用，因而直接溶栓治療還沒有成為一種標(biāo)準(zhǔn)的治療策略。靜脈血栓常引起血栓后綜合癥（postthrombotic syndr

2、ome），其治療效果欠佳且費用昂貴。 靜脈血栓的溶解和吸收主要是依賴于機體自身的慢性自然溶解機制。包括纖維蛋白溶酶介導(dǎo)的纖維蛋白溶解和蛋白水解酶介導(dǎo)的膠質(zhì)崩解等。新生肉芽組織長入血栓并取代血栓的過程即是血栓的機化過程。在血栓形成后的1-2天，單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞等在趨化因子的作用下進入血栓內(nèi)部，隨著肉芽組織的增生，新生血管逐漸形成，血流可通過這些管腔而實現(xiàn)靜脈血管的再通。如果機體對血栓的溶解和吸收徹底，血

3、管可完全再通，否則形成邊緣毛燥、管徑粗細不一的再通靜脈。并伴隨著靜脈瓣膜的破壞，形成一個管腔通暢但瓣膜關(guān)閉不全的靜脈系統(tǒng)，造成靜脈血液的逆流，最終引起血栓后綜合癥。因而增加微血管的生成和促進血栓的機化可減輕靜脈瓣膜的損害和再通靜脈的阻塞，從而預(yù)防血栓后綜合癥的發(fā)生。 最近研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞在靜脈血栓的溶解和吸收中發(fā)揮重要的作用。單核細胞能夠釋放和介導(dǎo)血管平滑肌細胞前血管生成因子的釋放。在體內(nèi)和體外實驗中均發(fā)現(xiàn)，血栓中的新生血管主

4、要出現(xiàn)在單核-巨噬細胞聚集的區(qū)域。體外實驗證實，在靜脈血栓中注入單核-巨噬細胞可以促進其溶解。更新的研究顯示，通過骨髓動員，各種來源于骨髓的干細胞和祖細胞參與了靜脈血栓的溶解和吸收。 早期的研究已經(jīng)揭示趨化因子在深靜脈血栓的溶解中發(fā)揮極其重要的作用。趨化因子是體內(nèi)廣泛存在的一類肽類炎癥介質(zhì)。它們扮演著趨化白細胞到達作用靶位和激活白細胞特有功能的角色。趨化因子主要有四個亞族。其中與深靜脈血栓溶解關(guān)系最密切的是CC類和CXC類趨化因

5、子。在實驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，加入外源性的MCP-1（一種CC類趨化因子）和IL-8（一種CXC類趨化因子）均能加速血栓的溶解。趨化因子與其特異性受體一起構(gòu)成細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮其對靶細胞的趨化、激活等作用。 CC類趨化因子主要趨化和激活單核細胞。它的作用需要通過其相應(yīng)的受體CCR來實現(xiàn)。MCP-1與其特異性受體CCR2構(gòu)成MCP-1/CCR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與單核細胞的遷移和游走，對于單核細胞的募集極為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，CCR2

6、基因敲除可抑制單核細胞在血栓中的聚集，MMP-2和MMP-9活性降低，血栓中膠原含量增加，血栓的體積增大，其溶解受到明顯抑制。 因此我們設(shè)想，若能主動增強靜脈血栓中單核細胞的功能，一定有助于促進靜脈血栓的溶解，實現(xiàn)血管的早期再通，減少血栓后綜合癥的發(fā)生。本研究擬探討通過運用細胞因子rhGM-CSF來增加單核細胞CCR2的表達，從而促進其聚集，為進一步研究其在靜脈血栓溶解中的機制打下一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 研究方法：

7、 1.細胞實驗 人單核細胞株THP-1培養(yǎng)于含10％胎牛血清、2.0mmol/L谷氨酰胺、10.0mmol/L HEPES、1.0 mmol/L丙酮酸鈉、5.0×10-5mol/Lβ-巰基乙醇、1.0×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的，RPMI-1640培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液中加入終濃度為0、40、80、160ng/ml的thGM-CSF。1×105個細胞接種于24孔培養(yǎng)板，6×105個細胞接種于100ml培養(yǎng)瓶。

8、 ELISA法檢測培養(yǎng)液中MCP-1的水平，操作按人MCP-1 ELISA Kit說明書進行。 培養(yǎng)的THP-1細胞總RNA提取按柱式小量細胞總RNA抽提試劑盒的說明步驟進行。RT-PCR擴增參照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒操作說明書進行。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖進行凝膠電泳，Goldview染色。凝膠成像分析系統(tǒng)進行檢測。 按照細胞總蛋白提取試劑盒說明書提取THP-1細胞總蛋白

9、。等量蛋白加樣于40％的聚丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺凝膠后120V電壓下電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。TBST封閉過夜。1：400兔抗人CCR2抗體溫育1.5h。洗膜，1：4，000 HRP結(jié)合的羊抗兔IgG抗體溫育2h。內(nèi)參照GAPDH的檢測同上述方法。結(jié)果以化學(xué)發(fā)光法顯色后進行OD值測定。 2.統(tǒng)計分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)根據(jù)具體資料采用F僉驗、Dunnett檢驗等檢驗方法。以P

10、值<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1. THP-1細胞生長情況 THP-1細胞培養(yǎng)24和48h后計數(shù)池計數(shù)。結(jié)果顯示rhGM-CSF對THP-1細胞的生長沒有促進或抑制作用。 2. MCP-1的水平 培養(yǎng)24h和48h后，THP-1細胞培養(yǎng)液中MCP-1水平在不同濃度組間均沒有顯著性差異。顯示rhGM-CSF對THP-1細胞分泌MCP-1沒有促進或抑制作用。 3. CCR2 mRNA

11、的表達 不同濃度組中，80ng/ml rhGM-CSF濃度組對THP-1細胞CCR2mRNA的表達促進作用最強。THP-1細胞在含80ng/ml rhGM-CSF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)36和48h后，其CCR2mRNA的表達穩(wěn)定增強。 4. CCR2蛋白的表達 不同濃度組中，80ng/ml rhGM-CSF濃度組對THP-1細胞CCR2蛋白的表達促進作用最強。THP-1細胞在含80ng/ml rhGM-CSF的培養(yǎng)液中培