β-淀粉樣肽誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞炎性反應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞的影響及人參皂甙的干預(yù)作用.pdf

1、第一部分Aβ誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞的上清致SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的建立 目的：掌握THP-1單核細(xì)胞和SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞的生長特征，建立Aβ1-40誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞激活對SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞系損傷的細(xì)胞模型。 方法：用相差顯微鏡觀察THP-1和SK-N-SH細(xì)胞的形態(tài)，用MTT比色法繪制SK-N-SH細(xì)胞的生長曲線。用乳酸脫氫酶(LDH)漏出率觀察SK-N-SH細(xì)胞的損傷程度。 結(jié)果：THP-1細(xì)

2、胞呈圓形或橢圓形，懸浮生長。SK-N-SH細(xì)胞呈錐形或梭形，有明顯的突起。Aβ可激活THP-1細(xì)胞，激活后THP-1的上清對神經(jīng)細(xì)胞系SK-N-SH有損傷作用，在2小時(shí)Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的上清對SK-N-SH細(xì)胞的損傷最明顯。人參皂甙與THP-1細(xì)胞預(yù)孵育30分鐘可明顯減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷。 結(jié)論：THP-1細(xì)胞可以模擬小膠質(zhì)細(xì)胞模型；Aβ1-40誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞可以作為炎癥損傷的細(xì)胞模型。 第二部分Aβ誘

3、導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶的激活和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及人參皂甙的作用 目的：研究Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激酶激活與炎性細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系，以及人參皂甙的作用機(jī)理。 方法：使用八種不同的激酶抑制劑作為工具藥及人參皂甙觀察對THP-1細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同激酶和炎性細(xì)胞因子的作用，分析它們之間的關(guān)系。用放射免疫法測定THP-1細(xì)胞上清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-8和TNFα的濃度，用免疫印跡法測定THP

4、-1細(xì)胞磷酸化ERK、磷酸化PTK、c-Jun和c-Fos的表達(dá)。 結(jié)果：用Aβ1-40(125nM)與THP-1細(xì)胞孵育2小時(shí)，可引起THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β、IL-8和TNFα增高。用工具藥Genistein(酪氨酸蛋白激酶抑制劑)、PD98059[有絲裂原活化的ERK激活激酶(MEK)抑制劑]、U0126(MEK1/2抑制劑)預(yù)處理可以抑制Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β、IL-8和TNFα；用工具藥GW5074(

5、c-Raf抑制劑)預(yù)處理可部分抑制Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β和TNFα，但不能抑制IL-8的表達(dá)；用工具藥SP600125(JNK抑制劑)預(yù)處理可以部分抑制Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β、TNFα和IL-8；用工具藥Wortmannin(PI3K抑制劑)、GF109203X(PKC抑制劑)和SB203580(p38MAPK抑制劑)預(yù)處理不能抑制Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-1β、TNFα和IL-8。人參皂甙與THP-1

6、細(xì)胞預(yù)孵育30分鐘，再用Aβ1-40(125nM)與THP-1細(xì)胞孵育2小時(shí)，人參皂甙可以抑制THP-1細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌，并且有劑量依賴關(guān)系。 結(jié)論：Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞IL-1β、TNFα和IL-8的表達(dá)與RTPK、c-Raf、ERK-1/2、c-JNK、c-Jun和c-Fos的激活或表達(dá)增高密切相關(guān)，而與p38MAPK、PI3激酶和PKC無關(guān)。RTPK、c-Raf、ERK-1/2、c-JNK、c-Jun和c-Fos可

7、能是減輕AD炎癥反應(yīng)潛在的作用靶點(diǎn)。人參皂甙可以通過抑制ERK-1/2磷酸化、c-Jun和c-Fos的表達(dá)減少細(xì)胞因子的表達(dá)，人參皂甙可能作為一種新的AD治療藥物。 第三部分Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的炎性反應(yīng)上清對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及人參皂甙的干預(yù) 目的：研究Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的炎性上清導(dǎo)致SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)理以及人參皂甙抗凋亡的作用機(jī)理。 方法：將Aβ1-40誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的炎性上清

8、加入到SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中。用免疫印跡法測定磷酸化p38MAPK、磷酸化Tau蛋白、突觸體素、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)；用免疫組織化學(xué)方法檢測MAP-2的表達(dá)；用Tunel法檢測SK-N-SH細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：Aβ1-40誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的炎性上清可引起SK-N-SH神經(jīng)細(xì)胞磷酸化p38MAPK、磷酸化Tau蛋白、Caspase-3和Bax的表達(dá)增強(qiáng)，突觸體素、MAP-2和Bcl-2表達(dá)下降，凋亡細(xì)

9、胞增加；人參皂甙預(yù)處理THP-1細(xì)胞與不加藥物的模型組相比，可見磷酸化p38MAPK、磷酸化Tau蛋白、Caspase-3和Bax的表達(dá)降低，突觸體素、MAP-2和Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞減少。 結(jié)論：Aβ1-40激活的THP-1細(xì)胞可通過增高神經(jīng)細(xì)胞p38MAPK、Tau的磷酸化和減少突觸體素的表達(dá)，促進(jìn)AD神經(jīng)元纖維纏結(jié)、突觸減少和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。人參皂甙可以抑制Aβ所引起的上述變化，可能是一種有前途的治療AD的藥物。

10、 第四部分Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞COX-2、一氧化氮合酶和一氧化氮的變化及人參皂甙的干預(yù) 目的:研究人參皂甙對Aβ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)環(huán)加氧酶-2(COX-2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)的影響。 方法:用免疫印跡法測定THP-1細(xì)胞表達(dá)COX-2和iNOS，用Griess法測定細(xì)胞上清中NO的濃度。 結(jié)果:Aβ1-40與THP-1細(xì)胞共孵育24小時(shí)的模型組COX-2和iNO