FABP4表達(dá)變化在Hcy誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞膽固醇聚積中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：同型半胱氨酸血癥(homocysteinemia,Hcy)已被公認(rèn)為是致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。本課題探討同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)及其拮抗劑葉酸(folicacid,FA)、維生素B12(vitaminB12,VB12)干預(yù)下,THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞內(nèi)脂代謝相關(guān)基因脂肪酸結(jié)合蛋白4(fattyacidbindingprotein4,FABP4)mRNA、蛋

2、白表達(dá)的變化和FABP4DNA甲基化水平的改變,及對(duì)總膽固醇(totalcholesterol,TC)、氧化低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白含量的影響,明確Hcy對(duì)THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞形成中FABP4表達(dá)及其DNA甲基化調(diào)控的影響。通過(guò)對(duì)FABP4基因采用基因重組技術(shù)對(duì)調(diào)控通路關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù),深入觀(guān)察FABP4對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響。為

3、FABP4及其DNA甲基化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的早期分子診斷及防治提供新的理論依據(jù),也為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供一個(gè)嶄新的視角。
　　方法：培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞,以4×106個(gè)接種于25cm2培養(yǎng)瓶,加入5ml含500nM佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)的培養(yǎng)液,37℃、5％CO2培養(yǎng)48h,顯微鏡下觀(guān)察顯示此時(shí)細(xì)胞形狀不規(guī)則并有偽足伸出,呈貼壁狀態(tài),證實(shí)其

4、已分化為巨噬細(xì)胞,棄去舊培養(yǎng)液并用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSaline,PBS)沖洗2-3遍,更換為含50、100、200、500mMHcy、100mMHcy+葉酸(FA)+維生素B12(VB12)的15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組,培養(yǎng)24h,以不加Hcy組(0mMHcy)為對(duì)照組,并設(shè)置pcDNA3.1-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和FABP4基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。采用熒光定量PCR(qu

5、antitativeRT-PCR,qRT-PCR)和Westernblotting檢測(cè)FABP4mRNA和蛋白的表達(dá);常規(guī)提取DNA,采用巢式降落式甲基化特異性PCR(nestedtouchdownmethylation-specificPCR,ntMS-PCR)檢測(cè)FABP4基因DNA甲基化改變;試劑盒酶法檢測(cè)細(xì)胞中總膽固醇含量的變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)氧化低密度脂蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(gluc

6、ose-regulatedprotein78,GRP78)、X盒結(jié)合蛋白1(X-boxbindingprotein1,XBP1)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-bindingproteinhomologousprotein,CHOP)含量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立了THP-1單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞模型,顯微鏡下觀(guān)察顯示其呈貼壁狀態(tài),形狀不規(guī)則并有偽足伸出的巨噬細(xì)胞。
　　2

7、.Hcy干預(yù)后,ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞內(nèi)GRP78、XBP1、CHOP和ox-LDL的含量明顯增加,但與Hcy濃度不呈量效關(guān)系,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.05),其中以100mMHcy組最明顯,而100+FA+VB12組,巨噬細(xì)胞內(nèi)GRP78、XBP1、CHOP和ox-LDL的含量又有所減少。
　　3.Hcy干預(yù)后,巨噬細(xì)胞內(nèi)TC含量明顯升高,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.05),同樣,與Hcy

8、濃度不呈量效關(guān)系,尤其是以100mMHcy組最明顯,有非常顯著性差異(P<0.01),說(shuō)明Hcy減少了THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的積聚明顯增加。
　　4.熒光定量PCR結(jié)果顯示:FABP4mRNA表達(dá)上調(diào),以100mMHcy組效應(yīng)最明顯(P<0.01);Westernblotting檢測(cè)FABP4蛋白的表達(dá)與其mRNA表達(dá)一致。
　　5.ntMS-PCR檢測(cè)FABP4基因DNA甲基化的結(jié)果顯示:在Hc

9、y干預(yù)后,50、100、200、500mMHcy組與對(duì)照組(0mMHcy)相比較,FABP4基因DNA甲基化程度分別降低了17.97%、30.47%、18.69%和18.63%,以100mMHcy組差異最明顯(P<0.01),而100+FA+VB12與100mMHcy組相比較,FABP4基因DNA甲基化程度反而增加了34.28%(P<0.01)。
　　6.構(gòu)建重組FABP4基因熒光真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,用熒光定量P

10、CR和Westernblotting檢測(cè)FABP4mRNA和蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,FABP4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的FABP4mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01),鑒定FABP4重組載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染成功。
　　7.FABP4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后,巨噬細(xì)胞胞內(nèi)膽固醇的聚積明顯增加,FABP4重組轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較,有顯著性差異(P<0.01),說(shuō)明FABP4減少了巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,使巨噬細(xì)胞內(nèi)TC的含量明顯增