血管緊張素Ⅱ?qū)θ私四I小管細(xì)胞銜接蛋白p66Shc表達(dá)及磷酸化的影響.pdf

1、研究背景:糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,是引起糖尿病人死亡最主要的原因。在DN的發(fā)病機制中,氧化應(yīng)激引起線粒體產(chǎn)生大量ROS是DN發(fā)病的關(guān)鍵機制和中心環(huán)節(jié)。以往研究認(rèn)為,DN的病理損害主要在腎小球,最新研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病的主要病理特征之一是腎小管細(xì)胞的氧化損傷,腎小管的氧化損傷不是繼發(fā)于腎小球損傷,而是DN的早期原發(fā)損傷。腎

2、素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-Angiotensin System,RAS)在腎臟生理及病理生理過程中有十分重要的作用,血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)是該系統(tǒng)最重要的效應(yīng)分子。大量研究證明,AngⅡ是促進腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素,它可以誘導(dǎo)線粒體ROS產(chǎn)生,引起細(xì)胞的氧化損傷。最近研究發(fā)現(xiàn),銜接蛋白p66Shc表達(dá)上調(diào)能夠引起線粒體ROS產(chǎn)生增加,加重細(xì)胞的氧化損傷,并且與第36位絲氨酸(Ser36)的磷酸化密切

3、相關(guān)。目前,關(guān)于銜接蛋白p66Shc在糖尿病腎病腎組織的表達(dá)情況及AngⅡ是否能影響腎小管細(xì)胞銜接蛋白p66Shc的表達(dá)與磷酸化國內(nèi)外尚未見報道。
　　目的:觀察銜接蛋白p66Shc在db/db小鼠腎組織的表達(dá)情況;研究AngⅡ?qū)θ私四I小管細(xì)胞(HK-2)p66Shc表達(dá)及磷酸化的影響。
　　方法:1、2型糖尿病db/db小鼠及對照組db/m小鼠各4只,在14周齡時處死,取腎臟組織,常規(guī)HE及Masson染色觀察兩組病理學(xué)

4、變化;并進行免疫組化及Western Blot檢測兩組小鼠腎組織中p66Shc蛋白的表達(dá)情況。2、常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞,以不同濃度AngⅡ刺激24h,Real TimePCR及Western Blot分別從基因及蛋白水平檢測AngⅡ?qū)K-2細(xì)胞p66Shc表達(dá)的影響。以高濃度AngⅡ刺激HK-2細(xì)胞,Western Blot檢測不同時間點p66Shc Ser36磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果:1、體內(nèi)實驗:HE和Masson染色顯

5、示,與db/m小鼠比較,db/db小鼠腎小球肥大,細(xì)胞數(shù)增多,系膜區(qū)增生,部分小管可見空泡變性及上皮細(xì)胞脫落,小管萎縮不明顯;免疫組化顯示,與db/m小鼠比較,p66Shc蛋白主要在db/db小鼠腎小管表達(dá)增加(P<0.05);WesternBlot顯示,與db/m小鼠比較,db/db小鼠腎組織p66Shc蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。2、體外實驗:與對照組比較,當(dāng)AngⅡ濃度在10-4μM及以上時,p66Shc mRNA及蛋白表達(dá)

6、明顯增加,且呈劑量依賴性(P<0.01);與對照組比較,Western Blot顯示濃度為1μM的AngⅡ刺激10min就能引起HK-2細(xì)胞p66Shc Ser36磷酸化水平上升,在30min明顯增加,在60min達(dá)到峰值,之后磷酸化水平逐漸下降,但仍處于較高水平(P<0.01)。
　　結(jié)論:1、銜接蛋白p66Shc主要在糖尿病腎病小鼠腎小管細(xì)胞中表達(dá)增高。2、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)人近端腎小管細(xì)胞p66Shc表達(dá)上調(diào),且呈劑量依賴性。