西洛他唑?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖及磷酸化P38MAPK表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景:
　　 西洛他唑是1978年日本大冢制藥有限公司合成的抗血小板類(lèi)化合物，1988年作為治療慢性動(dòng)脈閉塞癥的藥物在日本上市。隨著大型循證醫(yī)學(xué)證實(shí)，西洛他唑可以顯著改善慢性動(dòng)脈閉塞癥引起的下肢潰瘍、疼痛、發(fā)冷和間歇性跛行等缺血性癥狀，1999年美國(guó)FDA批準(zhǔn)其作為治療穩(wěn)定性間歇性跛行的藥物上市[1]。成為美國(guó)市場(chǎng)上第一個(gè)獲得作為治療該適應(yīng)癥的抗血小板聚集的藥物;在臨床上還被應(yīng)用于治療糖尿病等引起的外周血管性疾病[2]。

2、r>　　 西洛他唑是一種選擇性磷酸二酯酶3抑制劑，可抑制血小板及平滑肌內(nèi)磷酸二酯酶的水解，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，具有抗血小板聚集及血管擴(kuò)張作用。
　　 近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)西洛他唑有抗炎作用及抗平滑肌細(xì)胞增殖的作用，支架植入術(shù)后應(yīng)用西洛他唑可減少新生內(nèi)膜的增生和重構(gòu)，有抗晚期血管再狹窄的作用[3-5]。這些效應(yīng)將作為西洛他唑抗血小板效應(yīng)的補(bǔ)充且使之成為缺血性疾病獨(dú)特的重要治療。
　　 一、西洛他唑?qū)?dòng)脈粥樣硬化中血管內(nèi)皮細(xì)胞

3、的作用
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是常見(jiàn)的血管病變，是缺血性心腦血管疾病的常見(jiàn)原因，嚴(yán)重的危害著人類(lèi)的健康。既往的觀點(diǎn)認(rèn)為，AS是機(jī)體脂質(zhì)代謝障礙的結(jié)果，隨著研究的深入，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AS是血管炎癥性損傷的一種表現(xiàn)，認(rèn)為AS是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂后的炎癥反應(yīng)及在此基礎(chǔ)上的損傷-修復(fù)過(guò)程[6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞（VascularEndothelialCells，VEC）既是血管內(nèi)壁的一道機(jī)械屏障

4、，又是一個(gè)具有高度活性的、位于血液和組織分界內(nèi)表面的人體最大的內(nèi)分泌器官。它具有細(xì)胞通透性、選擇性屏障、止血、抗凝、纖溶、血液傳輸和血管活性物質(zhì)代謝及調(diào)節(jié)血管運(yùn)動(dòng)張力、產(chǎn)生生長(zhǎng)因子、纖維基質(zhì)增生等作用，參與炎癥反應(yīng)[7]，影響血管發(fā)生、血管通透性及液體平衡等。在動(dòng)脈粥樣硬化早期階段，損傷部位活化的內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)分泌黏附分子和化學(xué)趨化因子，如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集并遷移

5、到血管壁內(nèi)膜。VCAM-1在早期粥樣硬化斑塊形成時(shí)起主要作用，并且MCP-1是慢性炎癥反應(yīng)的媒介，二者可使單核細(xì)胞黏附。另外，活性氧與TNF-α也參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。有研究[8]表明細(xì)胞核因子-κB(NF-κB)激活基因在人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化的血管中表達(dá)增高。
　　 作為一種新型的磷酸二酯酶3(PDE3)抑制劑，西洛他唑的基本作用是抗血小板聚集。它有許多額外的細(xì)胞作用靶點(diǎn):可抑制PDE活性和阻礙環(huán)磷酸腺苷(cAMP)降解及轉(zhuǎn)化，

6、可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成及血管阻塞;減少黏附分子的表達(dá)（如VCAM-1），抑制細(xì)胞因子釋放和起效（如MCP-1、PDGF和TNF-α等），具有抗炎和抗動(dòng)脈抗粥樣硬化的作用[9];此外，通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平擴(kuò)張血管，促進(jìn)血管內(nèi)皮恢復(fù)和抑制血管增生，提高組織灌注，對(duì)缺血性腦組織起神經(jīng)保護(hù)作用[10,11]。研究發(fā)現(xiàn)西洛他唑?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，MATSUMOTO等[12]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明西洛他唑能通過(guò)增加內(nèi)皮依賴(lài)性超極化因

7、子的反應(yīng)來(lái)改善2型糖尿病大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的功能。進(jìn)一步的研究表明，西洛他唑可能通過(guò)ERK1/2和P38MAPK依賴(lài)途徑對(duì)抗由脂多糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[13]。除此之外，西洛他唑還有抑制炎癥細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用及抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的作用，MORI等[14]發(fā)現(xiàn)通過(guò)上調(diào)單核細(xì)胞cAMP的濃度，西洛他唑有抑制單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附的作用。
　　 二、西洛他唑?qū)ρ芷交〖?xì)胞的作用
　　 血管平滑肌細(xì)胞(vascular

8、smoothmusclecells，VSMC)是血管壁的主要成分之一，是決定血管活性和血管構(gòu)型的重要因素。其增殖在動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄和高血壓等多種血管性疾病的形成機(jī)制中起著重要作用。在參與AS形成的細(xì)胞體系中，其中VSMC是增殖體系中最活躍的細(xì)胞。臨床及實(shí)驗(yàn)研究[15.16]均證實(shí)西洛他唑能夠抑制VSMC增殖及預(yù)防冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后血管再狹窄。西洛他唑可以抑制由不同的生長(zhǎng)因子，包括血小板衍生因子(PDGF)胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因

9、子-1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖反應(yīng)，也可抑制由PI3GF誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞的增殖反應(yīng)[17,18]。近年來(lái)的研究[19]還顯示，血漿PAI-1的水平與冠心病、內(nèi)膜增生和再狹窄密切相關(guān)，而西洛他唑能通過(guò)各種機(jī)制包括下調(diào)TGF-B，JNK和P38信號(hào)途徑，抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，從而起到抗血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。
　　 三、西洛他唑?qū)z裂原活化蛋白激酶的作用
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mi

10、togen-activatedproteinkinase，MAPK)家族屬于高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布于真核生物胞漿中。MAPK信號(hào)通路是一條細(xì)胞外信號(hào)引發(fā)細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的重要途徑，在細(xì)胞形成、分化、生長(zhǎng)、增殖及凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[20]。目前發(fā)現(xiàn)MAPK家族有四條信號(hào)通路:即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase，ERK)、c-JunN端激酶(c-JunN-ter

11、minalkinase，JNK)、p38MAPK和ERK5/BMK1通路[21]。經(jīng)典的MAPK級(jí)聯(lián)反包括3個(gè)激活步驟:MAPK激酶激酶(mitogen-activatedproteinkinaseki-nasekinase，MAPKKK)激活后磷酸化并激活MAPK激酶(mitogen-activatedproteinkinasekinase，MAP-KK)，接著MAPKK通過(guò)雙重磷酸化鄰近的蘇氨酸和酪氨酸而激活MAPK，激活后的MAP

12、K可由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)作用于靶目標(biāo)。大量事實(shí)表明MAPK也是西洛他唑的作用靶點(diǎn)[22-24]。
　　 研究目的:
　　 西洛他唑目前在臨床上廣泛應(yīng)用于血管性疾病包括缺血性心腦血管疾病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防，也是抗血小板藥物治療的基礎(chǔ)。已有大量臨床研究證實(shí)，西洛他唑可減少與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)疾病的發(fā)生。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和血管平滑肌細(xì)胞增殖在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究旨在分別觀察西洛他唑?qū)w外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和

13、血管平滑肌細(xì)胞的增殖及磷酸化
　　 P38MAPK絲裂原活化蛋白激酶表達(dá)的影響，以進(jìn)一步從細(xì)胞和分子水平上闡述西洛他唑?qū)?dòng)脈粥樣硬化血管的保護(hù)作用。
　　 研究方法:
　　 1.96孔板上體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926，用終濃度為10、30、100、300umol/l的西洛他唑分別作用24小時(shí)并設(shè)立對(duì)照進(jìn)行比較，采用MTT法確定細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
　　 2.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy9

14、26，用不同終濃度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小時(shí)并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行比較，裂解細(xì)胞提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定總蛋白濃度，利用P38磷酸化抗MAPK抗體的蛋白免疫印記法測(cè)定磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)。
　　 3.在96孔板上體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞VSMC，用終濃度為10、30、100、300umol/l的西洛他唑分別作用24小時(shí)并設(shè)立對(duì)照進(jìn)行比較，采用CCK-8法確定細(xì)胞的

15、增殖狀態(tài)。
　　 4.體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞VSMC，用不同終濃度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小時(shí)并設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行比較，裂解細(xì)胞提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定總蛋白濃度，利用P38磷酸化抗MAPK抗體的蛋白免疫印記法測(cè)定磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.采用MTT法確定人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖狀態(tài):
　　 各組細(xì)胞增殖率分別

16、為對(duì)照組0.909±0.012，CLZ10μmo/L組0.904±0.026;CLZ30μmol/L組0.851±0.023;CLZ100μmol/L組0.670±0.013;CLZ300μmol/L組0.651±0.036。統(tǒng)計(jì)分析顯示30μmol/L、100μmol/L和300μmol/L的CLZ分別能明顯抑制HUVECs的增殖(P＜0.05)，并呈劑量依賴(lài)性。
　　 2.西洛他唑?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中磷酸化P38MAPK

17、蛋白表達(dá)的影響:以對(duì)照組的密度掃描結(jié)果為100，10μmol/L西洛他唑?qū)α姿峄疨38MAPK蛋白沒(méi)有明顯的作用(96.3±6.0，P＞0.05)。30μmol/L100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能夠明顯抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表達(dá)(92.5±2.4,72.6±5.2,70.6±3.3,P＜0.05)。
　　 3.采用CCK-8法確定大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖狀態(tài):
　　 各組細(xì)胞增殖率分別為

18、對(duì)照組0.835±0.022，CLZ10μmo/L組0.830±0.017;CLZ30μmol/L組0.796±0.022;CLZ100μmol/L組0.605±0.003;CLZ300μmol/L組0.581±0.032。統(tǒng)計(jì)分析顯示100μmol/L和300μmol/L的CLZ分別能明顯抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。
　　 4.西洛他唑?qū)Υ笫笮刂鲃?dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中磷酸化P38MAPK蛋白表達(dá)的
　　

19、 影響:
　　 以對(duì)照組的密度掃描結(jié)果為100，10μmol/L、30μmol/L的西洛他唑?qū)α姿峄疨38MAPK蛋白沒(méi)有明顯的作用(99.8±2.4，99.8±3.8，P＞0.05)。100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能夠明顯抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表達(dá)(86.7±1.6，77.9±2.3，P＜0.05)。
　　 研究結(jié)論:
　　 本研究提示西洛他唑通過(guò)部分抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中