高氮無(wú)鎳不銹鋼金屬支架材料對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖影響的研究.pdf

1、目的:
　　 自從20世紀(jì)80年代將金屬支架用于冠狀動(dòng)脈介入治療后，在冠狀動(dòng)脈內(nèi)植入支架治療已經(jīng)成為最主要的治療冠心病的模式。但是支架植入成功6個(gè)月后仍會(huì)有20％-30％的再狹窄發(fā)生。316L和317L作為目前應(yīng)用最為廣泛的冠狀動(dòng)脈內(nèi)不銹鋼金屬支架材料，其通常含有10％-14％的鎳元素，研究認(rèn)為316L和317L不銹鋼金屬支架材料中鎳元素的離子釋放引起的接觸過(guò)敏加重了炎癥反應(yīng)，刺激支架周圍的新生組織的增生，因而增大了再狹窄的可能

2、性。因此目前正在開(kāi)發(fā)的一種新型高氮無(wú)鎳（High nitrogen nickel free，HNNF）不銹鋼金屬支架材料，旨在通過(guò)去掉鎳元素降低鎳離子的潛在危害性及動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄率。本研究旨在探究HNNF不銹鋼金屬支架材料與316L不銹鋼金屬支架材料對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，從而為降低鎳離子的潛在危害性和血管支架內(nèi)再狹窄率以及新型不銹鋼金屬支架材料的研發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究HNNF不銹鋼金屬支架材料

3、和316L不銹鋼金屬支架材料對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)和人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cell，HUASMC）的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞的生長(zhǎng)活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)等方面的影響，為探究血管支架內(nèi)再狹窄機(jī)制，新型支架材料的研發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法:

4、r>　　 一、細(xì)胞粘附的測(cè)定
　　 將培養(yǎng)的HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于置有316L和HNNF兩種不銹鋼金屬材料的24孔培養(yǎng)板中，并設(shè)有正常培養(yǎng)細(xì)胞的對(duì)照組。各組均用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。培養(yǎng)4h后取出樣本，PBS液沖洗，去除未粘附細(xì)胞，用0.25％的胰酶消化后收集，臺(tái)盼藍(lán)染色后，倒置顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞粘附百分比。
　

5、　 二、觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況
　　 將體外培養(yǎng)的HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，將24孔培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3天和7天，待細(xì)胞基本長(zhǎng)成單層，取出長(zhǎng)有細(xì)胞的金屬片，用姬姆薩染液進(jìn)行細(xì)胞染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞在兩種不銹鋼金屬材料表面上的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。用Calcein AM染液進(jìn)行細(xì)胞染色，置于熒光顯微鏡下觀察HUVEC和HUASMC兩種

6、細(xì)胞在兩種不銹鋼金屬材料表面上的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。從形態(tài)上觀察HNNF和316L兩種不銹鋼金屬材料對(duì)HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響。
　　 三、細(xì)胞生長(zhǎng)活性的測(cè)定
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，將24孔培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，各組均在開(kāi)始培養(yǎng)后的1、3、5、7天取樣，通過(guò)CCK-8比色法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于4

7、50nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的OD值，求出每一組的平均OD值。計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGR): RGR=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100％，對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。定量分析316L和HNNF兩種不銹鋼金屬材料對(duì)HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞的細(xì)胞增殖及細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響。
　　 四、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組

8、24孔培養(yǎng)板中，將24孔培養(yǎng)板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，各組均在開(kāi)始培養(yǎng)后的7天內(nèi)連續(xù)收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 五、細(xì)胞周期分析
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，將各組細(xì)胞均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組細(xì)胞均在開(kāi)始培養(yǎng)7天后用不含血清的新鮮培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)22h，再更換為含有10

9、％胎牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在不同時(shí)間點(diǎn)分別取樣，并收集細(xì)胞置于離心管中，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。定量分析316L和HNNF兩種不銹鋼金屬支架材料對(duì)HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　 六、細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種子各組6孔培養(yǎng)板中，將各組細(xì)胞置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開(kāi)始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于離心管

10、中通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。定量分析316L和HNNF兩種不同不銹鋼金屬支架材料對(duì)HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響。
　　 七、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC和HUASMC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，各組均置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開(kāi)始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于1.5 mL離心管中，做好標(biāo)記。按照TRIzol說(shuō)明書(shū)的要求提取RNA，測(cè)定

11、各組RNA純度和濃度。按照Takara說(shuō)明書(shū)的要求，反轉(zhuǎn)錄得到DNA模板，然后按照Takara說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行Real-Time PCR的檢測(cè)。以基因GAPDH作為內(nèi)參，定量分析316L和HNNF兩種不銹鋼金屬支架材料對(duì)HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞基因水平表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、通過(guò)鏡下對(duì)HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目的觀察、CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞增殖活

12、性的檢測(cè)和流式細(xì)胞儀對(duì)HUVEC和HUASMC兩種細(xì)胞細(xì)胞周期的檢測(cè)可以看出培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞其細(xì)胞生長(zhǎng)水平低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞(p＜0.05)，但高于HUVEC細(xì)胞在體外培養(yǎng)的正常水平(p＜0.05);培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞其生長(zhǎng)水平低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的細(xì)胞(p＜0.05)，同時(shí)也低于HUASMC細(xì)胞在體外培養(yǎng)的正常水平(p＜0.05)

13、。
　　 2、通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)可以看出培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞在培養(yǎng)7天后其細(xì)胞早期凋亡的比例比培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞比例高。培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞在培養(yǎng)7天后其細(xì)胞早期凋亡的比例比培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料材料上的HUASMC細(xì)胞比例高。
　　 3、通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果可以看出培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞其與凋

14、亡相關(guān)的基因和與自噬相關(guān)的基因表達(dá)水平比培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞值高(p＜0.05)，說(shuō)明316L不銹鋼金屬材料比HNNF不銹鋼金屬材料可能更易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與細(xì)胞凋亡檢測(cè)的結(jié)果一致。
　　 4、培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUVEC細(xì)胞其基因Fas，caspase-8和caspase-3的mRNA水平的上調(diào)說(shuō)明從316L不銹鋼金屬材料釋放出的鎳離子可能通過(guò)Fas基因介導(dǎo)的外源凋亡途徑誘導(dǎo)了HUVEC細(xì)

15、胞的細(xì)胞凋亡。
　　 5、通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果可以看出培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞其與凋亡相關(guān)的基因和與自噬相關(guān)的基因表達(dá)水平比培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞值高(p＜0.05)，說(shuō)明HNNF不銹鋼金屬材料比316L不銹鋼金屬材料可能更易誘導(dǎo)HUASMC細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，提示HNNF不銹鋼金屬材料比316L不銹鋼金屬材料可能更易抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，與HUASMC細(xì)胞細(xì)胞凋亡檢測(cè)的結(jié)果

16、一致。
　　 6、培養(yǎng)在HNNF不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞其基因Fas、caspase-8、caspase-3和caspase-9的mRNA水平較培養(yǎng)在316L不銹鋼金屬材料上的HUASMC細(xì)胞其相應(yīng)基因mRNA水平上調(diào)，說(shuō)明HNNF不銹鋼金屬材料可能通過(guò)Fas基因介導(dǎo)的外源凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源途徑兩種途徑誘導(dǎo)了HUASMC細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過(guò)細(xì)胞形態(tài)的觀察、細(xì)胞生長(zhǎng)活性、

17、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的檢測(cè)以及實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HNNF不銹鋼金屬支架材料同對(duì)照組相比具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。
　　 2、與316L不銹鋼金屬支架材料相比，HNNF不銹鋼金屬支架材料具有抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)由于其不含有鎳元素，從而降低了316L不銹鋼金屬支架材料中鎳元素對(duì)細(xì)胞的潛在毒性作用。
　　 3、本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為降低血管支架內(nèi)再狹窄以及新型HNNF不銹鋼金屬支架材料的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)