人肝癌細(xì)胞中Tec表達(dá)及磷酸化水平的初步研究.pdf

1、背景和目的：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤，肝切除術(shù)仍是目前最有效的根治性手段，但大部分患者由于伴有嚴(yán)重的肝功不全或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不適合進(jìn)行手術(shù)切除或肝移植治療⑴。而現(xiàn)有的化療藥物選擇性不高，毒副反應(yīng)明顯，至今也沒有標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)性化療方案，放射治療由于適應(yīng)征有限效果也欠佳[2-3]。因此，具有特異性強(qiáng)、療效顯著、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)的分子靶向治療成為目前原發(fā)性肝癌治療研究的熱點(diǎn)和希望之一，更

2、深入地探索HCC致癌的分子機(jī)理，明確肝癌發(fā)生、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及其相互作用，尋找重要的關(guān)鍵信號(hào)蛋白分子靶點(diǎn)具有重要意義⑷。 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HepatocyteGrowthFactor，HGF)又名離散因子(ScatterFactor，SF)，是一種很強(qiáng)的刺激肝細(xì)胞增殖的絲裂原。其單一受體c-Met是一跨膜蛋白，由原癌基因c-met編碼⑸。HGF/c-Met可通過影響腫瘤細(xì)胞間粘附、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM

3、)降解、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力、參與腫瘤血管生成等多種途徑參與肝癌的發(fā)生發(fā)展⑹，腫瘤細(xì)胞發(fā)生的這一系列生物學(xué)效應(yīng)與HGF激活c-Met，導(dǎo)致ras/致分裂素激活蛋白(MAP)激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的級(jí)聯(lián)激活密切相關(guān)⑺。Tec是否參與肝癌細(xì)胞中HGF信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程目前尚不清楚。 Tec(tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma)是最初從肝癌組織

4、中篩選得到的一種存在于胞質(zhì)內(nèi)的非受體型蛋白酪氨酸激酶，是多種細(xì)胞因子、輔助分子及受體型蛋白酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要連接分子⑻。一方面，Tec能夠?qū)κ荏w型蛋白酪氨酸激酶(包括生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子受體、G蛋白耦聯(lián)受體、抗原受體)傳導(dǎo)的各種胞外刺激做出反應(yīng)，同時(shí)可被多種非受體型蛋白酪氨酸激酶調(diào)節(jié)，如Src、JAK、Syk和FAK家族激酶等⑼。另一方面，Tec參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)傳導(dǎo)路徑，包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)通路、磷脂酶C(

5、PLC)通路以及蛋白激酶C(PKC)通路⑽。在本課題中，我們旨在通過研究人正常肝、癌旁肝及肝癌組織中Tec(tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma)的表達(dá)及磷酸化水平，以及人肝癌細(xì)胞HepG2中Tec磷酸化與HGF分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相互之間的關(guān)聯(lián)，同時(shí)初步探討具體的作用機(jī)理，證實(shí)Tec的表達(dá)尤其是磷酸化水平異常與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制Tec的表達(dá)或直接下調(diào)其磷酸化水平可能部分逆轉(zhuǎn)

6、肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。 方法： 1.利用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化法(SP法)檢測(cè)肝癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織中Tec的表達(dá)及其磷酸化水平。 2.利用免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HGF刺激肝癌細(xì)胞株HepG2不同時(shí)間后Tec、Src的磷酸化表達(dá)水平。 3.利用WesternBlot方法檢測(cè)Src特異性抑制劑PP2、BTK抑制劑特異性LFM分別處理HepG2前后以及HGF刺激不同時(shí)間后重要的Tec相關(guān)信號(hào)蛋白分子

7、PY20、FAK、Erk1/2、STAT3、Raf的磷酸化表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.Tec在肝癌組織及非癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率無明顯差異，但在肝癌組織中的染色程度顯著高于非癌組織，且與組織分級(jí)有關(guān)(P＜0.05)。Tec磷酸化水平在肝癌組織中高于癌旁組織及正常肝組織(均P＜0.05)。 2.隨HGF刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，Tec、Src在HepG2中的磷酸化表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。 3.隨HGF刺激時(shí)間的延長(zhǎng)

8、，Raf在HepG2中的磷酸化表達(dá)水平并無增強(qiáng)，PY20、FAK、Erk1/2、STAT3的磷酸化表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，Src抑制劑PP2及BTK抑制劑LFM對(duì)Raf、Erk1/2磷酸化表達(dá)水平無明顯抑制效應(yīng)，對(duì)PY20、FAK、STAT3的磷酸化表達(dá)水平呈現(xiàn)部分抑制效應(yīng)。 結(jié)論： 1.Tec的表達(dá)異常與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制Tec的表達(dá)或直接下調(diào)其磷酸化水平可能影響肝癌的進(jìn)程。 2.首次證實(shí)T