PKCβ-p66Shc氧化應激通路對高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡的作用.pdf

1、目的：探討PKCβ/p66Shc氧化應激通路介導高氧誘導人肺泡Ⅱ型上皮A549細胞凋亡的作用,探討PKCβ抑制劑LY333531對高氧誘導肺泡上皮細胞的保護作用。
　　方法：本實驗是將體外傳代培養(yǎng)的人肺泡Ⅱ型上皮A549細胞系(A549細胞)作為研究對象。以高體積分數(shù)氧(高氧)誘導人A549細胞模型為基礎,以3L/min的速度通入含有95％氧氣的高純混合氣處理細胞。將實驗細胞A549隨機分為三組:對照組、高氧組,LY333531組

2、。對照組:加入含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng);高氧組:加入等量的上述培養(yǎng)液,換液后,通入3L/min的90%氧氣和5%二氧化碳高純混合氣10min,在培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng);LY333531組:用終濃度為10μmol/L的等量PKCβ特異性抑制劑LY333531的培養(yǎng)液預處理A549細胞24h后,再用高氧誘導A549細胞,10分鐘后密閉培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后收集細胞檢測以下指標:倒置相差顯微鏡下觀察A549細胞的形態(tài)

3、學改變并照相;流式細胞術檢測高氧及LY333531對A549細胞凋亡率的影響;采用SP細胞免疫化學方法檢測分組24h后PKCβ/Pin1/P66Shc/P66Shc-Ser36蛋白的表達;WesternBlot檢測24h后PKCβ/Pin1/P66Shc/P66Shc-Ser36蛋白的表達;激光共聚焦顯微鏡檢測分組24小時后P66Shc在線粒體內(nèi)的轉位;激光共聚焦顯微鏡檢測分組24小時后線粒體活性氧簇產(chǎn)生的情況;激光共聚焦顯微鏡檢測分組

4、24小時后線粒體膜電位的變化。
　　結果：(1)倒置顯微鏡下,細胞生長狀態(tài)良好,呈扁圓多角形,數(shù)量多,排列緊密,連接成片,懸浮細胞較少。高氧組生長狀態(tài)較差,細胞形態(tài)由典型的扁圓多角形細胞變成圓形或橢圓形,間隙增加,連接松散,活細胞數(shù)量明顯降低,懸浮細胞數(shù)量明顯增多。LY3333531組生長狀態(tài)欠佳,活細胞數(shù)量較高氧組增多,懸浮細胞數(shù)較高氧組減少,但是未達到對照組的水平;(2)流式細胞術結果顯示:高氧組與對照組相比,細胞凋亡率明顯增

5、加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而LY3333531組的凋亡率有所降低,與高氧組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);(3)免疫組化結果顯示,與對照組相比,高氧組24h后A549細胞內(nèi)PKCβ/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36蛋白表達均明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與高氧組相比,LY3333531組Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36的表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(4)

6、western-blot結果顯示,與對照組相比,高氧組24小時后A549細胞內(nèi)PKCβ/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36蛋白表達均明顯著增加,差異有顯著性(P<0.05)。與高氧組相比,LY3333531組Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36的表達明顯降低,差異有顯著性(P<0.05)。(5)激光共聚焦顯微鏡結果顯示:與對照組相比,高氧組細胞p66Shc蛋白的轉位率明顯增加,差異有顯著性(P<0.05),與高

7、氧組相比,LY3333531組轉位率明顯降低,差異有顯著性(P<0.05)。(6)激光共聚焦顯微鏡結果顯示:線粒體ROS呈紅色熒光,細胞核呈藍色熒光。正常對照組紅色熒光僅有微弱表達;與對照組相比,高氧組細胞紅色熒光含量顯著增加,差異有顯著性(P<0.05);LY333531組
　　紅色熒光含量較高氧組有所減少,差異有顯著性(P<0.05),但未減少至對照組水平(P<0.05)。(7)激光共聚焦顯微鏡結果顯示:與對照組相比,高氧組線

8、粒體膜電位△Ψm明顯下降,差異有顯著性(P<0.05);與高氧組相比,LY333531組線粒體膜電位升高,差異有顯著性(P<0.05),但未達到對照組水平(P<0.05)。
　　結論：高氧能誘導肺泡上皮細胞的損傷,能導致凋亡的發(fā)生。其具體的機制為高氧氣能誘導細胞內(nèi)內(nèi)PKCβ表達增多,進而Pin1、p66Shc表達增多,發(fā)生磷酸化,然后轉位于線粒體,線粒體ROS產(chǎn)生增多,線粒體膜電位△Ψm下降。相反,PKCβ抑制劑LY333531能