氧化應激狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細胞修復存活、凋亡的變化及p38MAPK信號轉導通路的分子機制.pdf

1、目的:氧療是一種臨床常用治療手段，挽救了大量新生兒的生命，但可帶來由于持續(xù)用氧治療后的一種肺氧化應激性損傷疾病-支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)。肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell，AT-Ⅱ)為肺泡上皮的干細胞，肺泡上皮的修復完全依賴AT-Ⅱ的增殖、分化為肺泡Ⅰ型上皮細胞(alveolar type Ⅰ epithelial cell，AT-Ⅰ

2、)。BPD的發(fā)生發(fā)展與AT-Ⅱ增殖、存活和凋亡密切相關。而p38蛋白激酶(p38 MAP kinase，p38MAPK)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路三個主要的亞家族之一，與細胞增殖、存活和凋亡密切相關。本文以體外培養(yǎng)的大鼠原代AT-Ⅱ為研究對象，以不同濃度過氧化氫(H<,2>O<,2>)處理AT-Ⅱ，探討活性氧(reactive oxygen species，

3、ROS)誘導AT-Ⅱ細胞存活、凋亡及p38MAPK對氧化應激狀態(tài)下AT-Ⅱ修復存活，凋亡的調(diào)控作用。 方法:以免疫粘附法分離純化清潔級Spraque-Dawley成年大鼠AT-Ⅱ，臺盼蘭拒染法鑒定細胞活性，改良巴氏染色法鑒定細胞純度，電鏡直接觀察AT-Ⅱ細胞形態(tài)為細胞培養(yǎng)物定性。采用過氧化氫(H<,2>O<,2>)處理模擬機體ROS攻擊AT-Ⅱ的體內(nèi)情況，建立氧化性細胞損傷模型。實驗分為對照組(加無血清培養(yǎng)基)、H<,2>O<,

4、2>處理組(無血清培養(yǎng)基中含10、100、500和1000μMH<,2>O<,2>)和p38MAPK干預組(加p38MAPK抑制劑SB203580)。采用倒置顯微鏡、透射電鏡觀察細胞形態(tài)學變化，以四甲基偶氮唑鹽酶反應比色法(MTT法)檢測細胞存活率，Annexin-V和PI雙染色后流式細胞術檢測細胞凋亡率，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westem blot)檢測H<,2>O<,2>處理后AT-Ⅱ細胞磷酸化p3 8MAPK(Phospho-p38M

5、APK，p-p38MAPK)的表達，并觀察p38MAPK特異性抑制劑SB203580干預后細胞存活率和凋亡率的變化及p-p38MAPK表達的變化。 結果:以胰蛋白酶分離，免疫粘附法純化建立AT-Ⅱ原代培養(yǎng)的方法可收獲細胞1-2×10<'7>個/鼠，純度和活性>90％。電鏡觀察培養(yǎng)40小時的細胞，可見AT-Ⅱ細胞特征性結構——嗜鋨性板層小體。H<,2>O<,2>處理AT-Ⅱ 180min，與對照組比較，10μMH<,2>O<,2>

6、處理組的細胞形態(tài)無明顯差異；100μMH<,2>O<,2>處理組細胞間隙稍增寬；500μMH<,2>O<,2>處理組細胞間隙增寬，貼壁細胞數(shù)量減少，細胞皺縮，胞內(nèi)可見空泡；1000μMH<,2>O<,2>處理組貼壁細胞數(shù)量大大減少，細胞皺縮明顯，可見脫壁細胞和細胞碎片，同時透射電鏡下觀察到凋亡細胞的凋亡小體。MTT法和流式細胞術檢測結果顯示，10μM和100μMH<,2>O<,2>攻擊AT-Ⅱ 180min，細胞存活率和凋亡率與對照組比

7、較無明顯變化(P>0.05)，而500μM和1000μMH<,2>O<,2>攻擊AT-Ⅱ可使細胞存活率由對照組的97.50±2.588％降至80.67±6.121％和44.50±2.429％(P<0.05)，凋亡率由7.8960±4.4065％增至29.2420±4.2045％和48.8800±8.6261％(P<0.05)。使用p38MAPK抑制劑SB203580干預后500μMH<,2>O<,2>處理AT-Ⅱ 180min，與單純5

8、00μMH<,2>O<,2>處理組比較，AT-Ⅱ貼壁細胞數(shù)量進一步減少，細胞間隙增寬，細胞皺縮明顯，可見脫壁細胞和細胞碎片，AT-Ⅱ存活率更加降低(P<0.05)和凋亡率進一步增高(P<0.05)。另外，H<,2>O<,2>可刺激p-p38MAPK陽性表達，以刺激15min表達最強。p38MAPK抑制劑SB203580能有效阻斷H<,2>O<,2>刺激下p-p38MAPK的陽性表達。 結論： 1．以胰蛋白酶分離、免疫粘附