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文檔簡介
1、目的:研究肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響以及與p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系,揭示HNF4α抗肝癌的機(jī)制。
方法:
1.收集處于對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞HepG2,利用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染技術(shù)用外源基因pCMVHNF4α轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2,對(duì)照組轉(zhuǎn)染pEGFP-N1,轉(zhuǎn)染24h后將培養(yǎng)基更換為新鮮的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h熒光顯微鏡觀察對(duì)照組綠色熒光蛋白表達(dá),選取三個(gè)視野白光下計(jì)
2、算視野內(nèi)細(xì)胞數(shù),激發(fā)光下計(jì)算同視野發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù),計(jì)算對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率,Western blot檢測(cè)目的基因在肝細(xì)胞HepG2中的蛋白表達(dá)。
2.p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑SB203580阻斷p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,AnnexinV-FITC-PI雙染細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率,比較轉(zhuǎn)染HNF4α組的肝癌細(xì)胞HepG2凋亡率與轉(zhuǎn)染pCMV組以及HNF4α+SB203580組凋亡率。RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基C
3、aspase-3、Fas表達(dá)量,比較HNF4α組兩種基因表達(dá)量與pCMV組以及HNF4α+SB203580組兩種基因表達(dá)量。
結(jié)果:
1.利用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染技術(shù)用HNF4α轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2,熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組綠色熒光蛋白表達(dá),計(jì)算48h時(shí)對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率為57%,Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染HNF4α蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,與對(duì)照組相比HNF4α蛋白表達(dá)量有顯著差異。
2.流式細(xì)
4、胞儀檢測(cè)各組凋亡率,轉(zhuǎn)染HNF4α組的肝癌細(xì)胞HepG2凋亡率與轉(zhuǎn)染pCMV組以及HNF4α+SB203580組凋亡率相比均明顯升高,HNF4α組凋亡率與pCMV組和HNF4α+SB203580組有顯著性差異。RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Fas表達(dá)量,HNF4α組兩種基因表達(dá)量比轉(zhuǎn)染pCMV組以及HNF4α+SB203580組兩種基因表達(dá)量明顯升高,HNF4α組Caspase-3、Fas表達(dá)量與pCMV組和HNF4α
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