Tau蛋白的PKA磷酸化位點突變體對其磷酸化的影響.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病，神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）和老年斑（senile plaque）為其主要病理特征，神經(jīng)原纖維纏結(jié)的數(shù)量與病人認知功能嚴重程度密切相關(guān)。構(gòu)成NFT的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau。Tau蛋白的主要功能是促進微管組裝，維持微管穩(wěn)定性，維持神經(jīng)元細胞內(nèi)的軸突運輸。當tau蛋白被異常過度磷酸化，并在

2、細胞內(nèi)形成了聚積后，導(dǎo)致tau蛋白功能異常，引起微管解聚，最后促使神經(jīng)元發(fā)生退行性變。Tau蛋白的磷酸化水平受多種激酶的調(diào)節(jié)，尤其是PKA和GSK-3β，在tau蛋白的磷酸化過程中起著重要作用。激酶活性上調(diào)是導(dǎo)致tau蛋白異常過度磷酸化的重要原因。已有研究報道，Tau的過度磷酸化可能是多種激酶聯(lián)合作用的結(jié)果，tau的某些位點被一種激酶磷酸化后，可以促進或抑制其他激酶對tau蛋白磷酸化位點的磷酸化，如動物整體和體外試驗表明，PKA對tau

3、蛋白某些位點的預(yù)磷酸化可促進GSK-3β對tau的磷酸化作用，在GSK-3β活性不明顯增加的情況下，能促使tau蛋白過度磷酸化，其具體作用機制尚不清楚。 為了探討tau的PKA磷酸化位點是如何影響tau蛋白生物學(xué)功能，從而闡明體內(nèi)PKA與GSK-3β共同調(diào)節(jié)tau蛋白的磷酸化的機制。我們構(gòu)建了含不同PKA磷酸化位點突變的tau原核與真核表達重組體，用真核載體在細胞水平，探討tau蛋白PKA磷酸化位點預(yù)磷酸化如何改變tau的底物特性

4、、聚積性質(zhì)和生物學(xué)功能等。 本實驗分別在HEK293/wt細胞和N2a/wt細胞上瞬時轉(zhuǎn)染不同重組tau的真核表達載體，再用PKA特異性激活劑forskolin，以及forskolin與GSK-3β特異性抑制劑SB聯(lián)合處理，以確定是GSK-3β的作用，最后分別用免疫印跡技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測tau蛋白的磷酸化狀態(tài)及其分布聚集狀態(tài)。結(jié)果顯示：Forskolin 可以通過激活PKA,使tau蛋白PKA 磷酸化位點磷酸化但不能使其突變

5、位點磷酸化；當tau蛋白409 位點的絲氨酸突變?yōu)楸彼釙r,Ser262 位點的磷酸化程度減弱,Ser404 位點沒有被磷酸化；Tau蛋白409 位點的絲氨酸突變?yōu)楣劝彼釙r，Ser262 位點的磷酸化程度增強，而Ser404 位點依舊沒有被磷酸化；TauS214A、tauS262A、tauS409A 與tauS409E蛋白較tauWT蛋白的Thr231位點的磷酸化狀態(tài)均有不同程度的減弱；TauWT 在forskolin 作用下其Ser3

6、96/404（PHF-1 檢測的位點）的磷酸化程度增加了，而tauS214A、tauS262A 及tauS409A 在forskolin 處理后Ser396/404 位點的磷酸化程度均降低了，在forskolin+SB 聯(lián)合作用下Ser396/404 位點幾乎不能被磷酸化。 以上研究結(jié)果表明：1. Ser409位點的磷酸化可以使tauSer262位點更易被相應(yīng)的激酶磷酸化，并且Ser409突變使Ser404位點不易被磷酸化。2.