醛固酮對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞血小板反應(yīng)蛋白-1表達(dá)及增殖的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化是各種原因引起的慢性腎臟病變最后的共同結(jié)局，最終導(dǎo)致終末期腎功能衰竭。盡管腎臟纖維化發(fā)生的機(jī)制迄今仍未闡明，大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)腎小管間質(zhì)組織的改變較腎小球的改變更能預(yù)示進(jìn)展性腎臟疾病的預(yù)后，造成這一過程的直接原因是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度增加及降解減少。研究表明，血小板反應(yīng)蛋白1(TSP-1)在腎間質(zhì)血管生成過程中具有重要作用，TSP-1是內(nèi)源性血管生成抑制物，具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制新生血管生成，活化TGF

2、-β1功能。TSP-1可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抑制血管新生并通過抑制腎小管周圍毛細(xì)血管生成，促進(jìn)腎間致纖維化。 近年來大量的研究表明，腎內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在腎臟纖維化發(fā)生中起著十分關(guān)鍵的作用，過去一直認(rèn)為血管緊張素II(AngII)是這一系統(tǒng)中造成腎損害的主要物質(zhì)。近年的研究結(jié)果表明，在進(jìn)展性腎臟疾病中，醛固酮(ALD)亦是重要的致病因素之一，ALD可通過血流動(dòng)力學(xué)和直接作用于腎臟而發(fā)揮作用

3、，其具有不完全依賴AngII的獨(dú)立作用，特別是在致器官纖維化方面，但其作用機(jī)制目前尚未完全明了。近年的研究顯示，ALD不僅可以導(dǎo)致鈉水潴留，而且可以促進(jìn)組織膠原沉積、纖維化，如腎臟、心臟、血管等器官纖維化。腎臟本身產(chǎn)生的ALD在局部同樣促進(jìn)組織膠原的沉積，上調(diào)一些致纖維化因子；另外，調(diào)節(jié)血管緊張度，影響血壓；通過調(diào)節(jié)鈉-鉀-ATP酶合成和功能，影響細(xì)胞功能。ALD在進(jìn)展性腎損害中發(fā)揮重要作用，血清ALD水平的升高，促進(jìn)了腎小管基膜增厚、

4、小管上皮細(xì)胞萎縮、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)小動(dòng)脈壁增厚，可刺激腎間質(zhì)Ⅰ型膠原合成和纖維連接蛋白(FN)分泌，上調(diào)TGF-β1，而TGF-β1可誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，活化為MFB，參與腎間質(zhì)中MFB的積聚，增加ECM堆積從而加速小管間質(zhì)纖維化。有文獻(xiàn)報(bào)道在正常人近端腎小管上皮細(xì)胞中無TSP-1的表達(dá)，在刺激誘導(dǎo)下其表達(dá)合成增多。但ALD對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞TSP-1的表達(dá)有何影響，是否能誘導(dǎo)其表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖

5、，進(jìn)而促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，目前僅有極少量報(bào)道。因此，本課題利用體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞，研究ALD對(duì)腎小管上皮細(xì)胞TSP-1的表達(dá)及增殖的影響，以探討ALD在腎間質(zhì)纖維化中的作用及可能的發(fā)病機(jī)制。 方法： 1.人近端腎小管上皮細(xì)胞(HKCs)的培養(yǎng)：HKCs購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心，使用DMEM/F12培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、100U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，于37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)

6、。實(shí)驗(yàn)分兩組：空白對(duì)照組及不同濃度ALD組。觀察不同濃度(10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)ALD及不同時(shí)間(10-6 mol/L ALD組作用于人近端腎小管上皮細(xì)胞24h、48h及72h)對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞TSP-1 mRNA的表達(dá)及增殖的影響。 2.應(yīng)用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)觀察ALD對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞TSP-1 mRNA表達(dá)的影響。 3.四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法觀察不同濃

7、度的ALD對(duì)人近端腎小管上皮細(xì)胞增殖的影響。 4.本實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料用-x±s表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。 結(jié)果： 1.RT-PCR結(jié)果顯示正常培養(yǎng)條件下人近端腎小管上皮細(xì)胞不表達(dá)TSP-1；ALD能誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞TSP-1的表達(dá)，并隨著濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，TSP-1表達(dá)逐漸增加；呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性的趨勢(shì)。 2.MTT結(jié)果均顯示ALD促進(jìn)人近端腎小管上皮細(xì)胞的增殖，

8、隨著ALD濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性的趨勢(shì)。 結(jié)論： 1.體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下不表達(dá)TSP-1。 2.ALD可以誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞TSP-1的表達(dá)，并呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性的特點(diǎn)。 3.ALD可以促進(jìn)人近端腎小管上皮細(xì)胞增殖，呈劑量和時(shí)間依賴性的特點(diǎn)。 4.ALD的腎損傷作用部分可能是通過誘導(dǎo)TSP-1的分泌，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖等作用，參與