晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞肥大及間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：在這項(xiàng)研究中，觀察AOPPs刺激是否引起HK-2細(xì)胞（人近端腎小管上皮細(xì)胞株）的CTGF表達(dá)增加，及進(jìn)一步探討CTGF是否參與AOPPs誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞肥大和轉(zhuǎn)分化。此外，JNK信號(hào)通路在此過(guò)程中的作用。
　　方法：1、AOPPs-BSA的制備及含量測(cè)定
　　將牛血清白蛋白(BSA，100 mg/mL)與次氯酸溶液（HOCl，200 mmol/L）等體積混合，室溫下反應(yīng)30min，用PBS透析24小時(shí)以去除殘余的次氯

2、酸。制備的AOPPs樣品通過(guò)Detoxi-Gel凝膠柱消除污染類毒素。所得AOPPs樣品內(nèi)毒素的水平經(jīng)動(dòng)態(tài)內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒（Sigma公司）評(píng)估低于0.025EU/ml。
　　2、HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)
　　HK-2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，使用DMEM/F12培養(yǎng)液（含10％熱滅活的胎牛血清、100μ g/mL濃度的鏈霉素、100 U/mL濃度的青霉素）進(jìn)行培養(yǎng)，放置于含5％二氧化碳、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

3、
　　3、siRNA干擾
　　非特異性siRNA及CTGF的特異性siRNA是購(gòu)自上海GenePharma公司。siRNA干擾細(xì)胞使用Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司）。CTGF的特異性siRNA為CCGACTGGAAGACACGTT。在此實(shí)驗(yàn)中我們使用了非特異性siRNA作為陰性對(duì)照。CTGF siRNA的干擾效果通過(guò)western-blot測(cè)定進(jìn)行評(píng)估。
　　4、RT

4、-PCR
　　按照試劑說(shuō)明書(shū)利用TRIzo試劑（購(gòu)自Invitrogen公司）提取細(xì)胞總RNA。用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，USA)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR進(jìn)行使用PCR擴(kuò)增儀和SYBR Green熒光染料(TaKaRa，Japan)。RT-PCR的定量遵循以下反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2min，95℃變性30s，60℃退火35s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。所有數(shù)據(jù)都使用內(nèi)參β-actin規(guī)范化，使用2-DDCt方法分析

5、基因的表達(dá)水平。
　　5、Western-blot檢測(cè)(CTGF, E-cadherin, vimentin, JNK, and Phospho-JNK)
　　細(xì)胞在RIPA緩沖液里進(jìn)行溶解，溶解產(chǎn)物使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。然后電轉(zhuǎn)移SDS-PAGE凝膠上的蛋白質(zhì)。隨后，加入封閉液封閉PVDF膜，放置于搖床上室溫下緩慢搖動(dòng)2h，加入一抗4℃下緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。一抗作用結(jié)束后，PVDF膜用TBST反復(fù)漂洗，然后

6、加入稀釋好的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記好的二抗室溫下孵育1h。使用X光片將PVDF膜進(jìn)行顯影成像并掃描分析。
　　結(jié)果：1、AOPPs誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞CTGF的表達(dá)升高
　　AOPPs處理組CTGF的蛋白及mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，在12小時(shí)達(dá)到最高峰，持續(xù)至24小時(shí)仍顯著高于對(duì)照組。
　　2、CTGF參與AOPP引起的HK-2細(xì)胞肥大和EMT
　　將CTGF siRNA轉(zhuǎn)染入AOPPs處理的HK-2細(xì)胞，

7、可使CTGF蛋白表達(dá)水平顯著下降。Western-blot檢測(cè)及RT-PCR均顯示:與non-specific siRNA干擾對(duì)照組相比，特異性CTGF siRNA轉(zhuǎn)染顯著逆轉(zhuǎn)AOPPs引起的HK-2細(xì)胞鈣粘蛋白的表達(dá)抑制和波形蛋白超表達(dá)。阻斷CTGF明顯下調(diào)AOPPs誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的肥大指數(shù)。
　　3、CTGF通過(guò)JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)AOPPs觸發(fā)的HK-2細(xì)胞肥大和EMT
　　AOPPs刺激誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞JNK磷酸化

8、水平升高，這表明AOPPs參與激活HK-2細(xì)胞中的JNK信號(hào)通路。JNK抑制劑(SP600125)顯著阻礙了AOPPs誘導(dǎo)的JNK磷酸化。同時(shí)，JNK抑制劑顯著地抑制AOPPs引起的HK-2細(xì)胞鈣粘蛋白表達(dá)減少和CTGF、波形纖維蛋白在mRNA及蛋白水平的表達(dá)升高。此外，AOPPs誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的肥大指數(shù)也被SP600125顯著抑制。
　　結(jié)論：1、本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)AOPPs可誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞肥大和EMT;
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